国家自然科学基金(30300090)
- 作品数：5 被引量：22H指数：3
- 相关作者：吴军贺伟峰代飞陈希炜张小容更多>>
- 相关机构：第三军医大学西南医院第三军医大学成都军区昆明总医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家重点实验室开放基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学天文地球更多>>
- 腺病毒介导的CTLA-4Ig基因转染人骨髓间充质干细胞成骨特性研究被引量：2
- 2007年
- 目的通过腺病毒介导CTLA-4Ig基因转染人骨髓间充质干细胞(human marrowmesenchymal stem cells,hM-SCs),观察被修饰细胞CTLA-4Ig蛋白表达情况,以及基因修饰对hMSCs诱导成骨特性的影响。方法采用荧光显微镜观察腺病毒介导CTLA-4Ig基因转染hMSCs的绿色荧光蛋白表达,流式细胞术检测确定转染率,观察对比转染前后细胞形态和细胞周期,用免疫细胞化学方法检测转染hMSCs的CTLA-4Ig蛋白表达,转染hMSCs成骨诱导培养3周后进行成骨特异性标记检测。结果分离培养的hMSCs CD105表达阳性,CD34表达阴性。重组腺病毒介导的CTLA-4Ig基因转染hM-SCs的转染率为81.14%,CTLA-4Ig基因转染hMSCs(CTLA-4Ig-hMSCs)的形态无明显变化,生长良好。免疫细胞化学结果显示,CTLA-4Ig-hMSCs的CTLA-4Ig蛋白表达阳性,诱导培养3周的CTLA-4Ig-hMSCs,碱性磷酸酶染色呈强阳性,免疫细胞化学检测骨钙素表达阳性,钙的四环素荧光标记法显示细胞间有钙的沉积。结论腺病毒介导的CTLA-4Ig基因转染hMSCs能够分泌CTLA-4Ig蛋白,并保持了成骨分化潜能,可用于异基因hMSCs作为骨组织工程种子细胞的应用研究。
- 石东文代飞陈希炜贺伟峰胡晓红罗高兴吴军
- 关键词：HMSCSCTLA-4IG基因转染诱导成骨
- 基因修饰hMSCs作为骨组织工程种子细胞异种移植的实验研究
- 目的人骨髓间充质干细胞(Human bone marrow derived mesenchymal stem cell,hMSCs)目前被认为是骨组织工程最佳的种子细胞。但自体hMSCs数量有限、体外扩增和组织构建需要较...
- 代飞吴军易绍萱陈烯伟贺伟峰
- 关键词：CTLA4IG骨组织工程免疫排斥
- 文献传递
- Nucleofector^(TM)与脂质体转染PA317细胞效率的比较被引量：5
- 2004年
- 目的 比较传统的脂质体转染技术与NucleofectorTM转染技术将pLXSN CTLA4Ig TRES2 EGFP重组质粒转染入PA3 17细胞的效率。方法 分别用脂质体技术与NucleofectorTM 转染技术将pLXSN CTLA4Ig IRES2 EGFP重组质粒转染PA3 17细胞 ,应用倒置荧光显微镜、流式细胞仪检测转染后PA3 17细胞绿色荧光蛋白表达情况及阳性细胞率 ,比较两种方法的转染效率。结果 脂质体转染后 4、8h未观察到阳性细胞 ,转染后 12h阳性率为 ( 0 5 9± 0 2 ) %,转染后 2 4h阳性率为 ( 4 3 9± 2 43 ) %;NucleofectorTM 转染技术转染后约 4h观察到阳性细胞 ,转染后 12h阳性率为 ( 12 2 7± 3 3 8) %,转染后 2 4h阳性率为 ( 5 0 16± 2 41) %。两者比较 ,在转染后 12、2 4h ,后者阴性率显著高于前者 (P <0 0 1)。结论 NucleofectorTM 技术与传统的脂质体技术比较 ,是一种具有转染速度快。
- 代飞吴军陈希炜贺伟峰张小容
- 关键词：CTLA4IG脂质体
- 基因修饰人骨髓间充质干细胞作为骨组织工程种子细胞异种移植的实验研究被引量：10
- 2005年
- 目的观察人细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4-免疫球蛋白融合蛋白(hCTLA4-Ig)基因修饰的人骨髓间充质干细胞(hMSCs)作为种子细胞异种移植到F344大鼠体内是否成骨,探索获得骨组织工程异基因种子细胞的一种方法。方法应用含有目的基因hCTLA4-Ig和增强绿色荧光蛋白(EGFP)的逆转录病毒感染第1代hMSCs,应用G418筛选出抗性细胞群(hMSCs-CTLA4);用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学方法分别检测hMSCs-CTLA4中hCTLA4-IgmRNA和蛋白质表达。用荧光激活细胞分选仪(FACS)检测hMSCs-CTLA4中表达hCTLA4-Ig蛋白的阳性率。将hMSCs-CTLA4作为种子细胞在体外构建组织工程骨并移植到F344大鼠皮下,用X线片、组织形态学、免疫组织化学方法分别观察其体内成骨状况和hCTLA4-Ig表达情况。结果分离的hMSCsCD105表达阳性,CD34表达阴性。hMSCs-CTLA4的细胞形态呈梭形,与hMSCs比较无明显改变;倒置荧光显微镜观察见绝大多数细胞呈绿色,强阳性表达EGFP。RT-PCR、免疫细胞化学结果分别证实hMSCs-CTLA4表达hCTLA4-IgmRNA和蛋白。FACS检测结果显示:hMSCs-CTLA4表达hCTLA4-Ig蛋白的阳性率为78.4%。本实验构建的组织工程骨,每克脱钙骨基质(DBM)上吸附、生长的细胞约(1～1.5)×106个。DBM/hMSCs-CTLA4组植入F344大鼠皮下术后2～12周均可检测到hCTLA4-Ig阳性表达细胞,8～12周出现人源性新生骨组织;而单纯DBM组与DBM/hMSCs组表现为DBM逐渐被吸收,代之以纤维结缔组织,没有新生骨组织出现。结论以hMSCs-CTLA4作为种子细胞构建的组织工程骨异种移植到F344大鼠皮下可以成骨。hCTLA4-Ig基因修饰的人骨髓间充质干细胞(hMSCs)可能作为骨组织工程异基因种子细胞的来源。
- 代飞吴军许建中王序全陈烯伟贺伟峰
- 关键词：骨髓间充质干细胞骨组织工程人骨髓间充质干细胞组织工程种子细胞异种移植基因修饰细胞毒性T淋巴细胞相关抗原
- 人端粒酶逆转录酶基因和EGFP共表达真核表达载体的构建及鉴定被引量：3
- 2004年
- 目的 构建并鉴定人端粒酶逆转录酶 (humantelomerasereversetranscriptase ,hTERT)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)双基因共表达重组真核表达质粒。方法 扩增 pGRN1 4 5质粒并酶切回收hTERT片断 ,利用基因重组技术将hTERT连接到 pIRES2 EGFP载体中并酶切鉴定。用NucleofectorTM 技术将构建的重组质粒转染NIH3T3细胞系。结果 成功构建了hTERT和EGFP双基因共表达重组真核表达质粒 ,并成功转染了NIH3T3细胞。结论 重组质粒hTERT pIRES2 EGFP可以被成功导入细胞并表达EGFP 。
- 代飞吴军易绍萱贺伟峰陈希炜张小容
- 关键词：HTERT双基因共表达PIRES2-EGFP
- hTERT基因转染显著延长人骨髓间充质干细胞增殖能力的实验研究被引量：3
- 2007年
- 目的构建含有端粒酶逆转录酶(human telom erase reverse transcriptase,hTERT)基因的逆转录病毒,感染人骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells,hMSCs),观察外源性hTERT基因在hMSCs中的表达及其对hMSCs端粒酶活性和细胞增殖能力的影响。方法构建pLXSN-hTERT质粒,BamHⅠ酶切和测序鉴定,转染PT67包装细胞,G418抗性筛选获得产病毒阳性细胞克隆。用产病毒细胞珠和hMSCs共培养的方法转染hMSCs,G418抗性筛选。以未转染hM-SCs作为对照,用TRAPEZE方法检测hTERT基因转染hMSCs的端粒酶活性,用流式细胞仪检测细胞周期,并观察转染hMSCs的生长情况。结果成功构建了hTERT基因重组pLXSN-hTERT质粒,建立了产病毒pLXSN-hTER-PT67细胞株。获得了hTERT-hMSCs细胞群,与未转染的hMSCs相比,hTERT-hMSCs细胞群端粒酶活性明显增强,hTERT蛋白阳性表达细胞百分率提高,细胞的生命周期显著延长,细胞传代至46代,形态无明显改变,生长良好。结论逆转录病毒载体介导的hTERT基因转染可增强hMSCs的端粒酶活性,提高hMSCs的增殖能力。
- 石东文代飞池君陈希炜贺伟峰胡晓红罗高兴吴军
- 关键词：HTERT逆转录病毒端粒酶人骨髓间充质干细胞
