国家自然科学基金(30772065)
- 作品数：10 被引量：101H指数：6
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- 一个类孟买血型家系的α1,2岩藻糖基转移酶基因突变分析被引量：10
- 2010年
- 目的 研究1个中国人类孟买型血型家系的分子遗传背景.方法 以血型血清学方法鉴定先证者及其家系的红细胞ABO和H表型,应用聚合酶链反应扩增类孟买表型家系的ABO基因第6、7外显子和α1,2岩藻糖基转移酶基因（α-1,2-fucosyltransferase,FUT1）编码区,PCR产物直接测序分析,并通过克隆测序法对存在FUT1基因复合杂合的样本进行单倍体序列分析.结果 通过血清学技术在9个家系成员中鉴定了3个类孟买型,直接测序发现先证者FUT1基因存在35C/T、235G/C和682A/G复合杂合.单倍体序列分析表明先证者的FUT1基因型为h235c/h35T＋628G.其中h235C等位基因引起α1,2岩藻糖基转移酶G79R替换,h35＋628G等位基因引起α1,2岩藻糖基转移酶A12V和M228V替换.结论 在中国人群中发现一种新的类孟买表型相关的FUT1基因突变235G〉C.
- 许先国洪小珍刘瑛应燕玲陶苏丹和艳敏朱发明吕杭军严力行
- 关键词：类孟买型FUT1基因
- ABO血型新等位基因O61的分子生物学研究被引量：6
- 2010年
- 本研究探讨ABO新等位基因O61的分子机制。利用单克隆抗体检测标本红细胞ABO血型抗原,标准A、B、O红细胞检测标本血清中的ABO抗体。采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术扩增ABO基因的第5至7外显子序列,PCR产物经双酶切后直接测序分析6和7外显子。1例B表型标本采用基因组单链抽提技术分离杂合基因型标本的2条单体型,对分离的单体型扩增后进行ABO基因测序分析。结果表明,在417例标本中发现3个标本743位碱基发生突变,其中2例表型为O型,1例为B型。2例O型直接测序分析显示,6和7外显子有261G缺失及743G/C杂合。1例B型直接测序结果为261G/缺失及297A/G、526C/G、743G/C、657C/T、703G/A、796C/A、803G/C、930G/A杂合。采用基因组单链抽提技术将B型标本的两条单体型进行分离,对分离的单体型扩增后进行ABO基因测序分析,结果显示,2条链分别为B101和突变的O型。将突变的新O型基因提交血型抗原基因突变数据库,被正式命名为O61。结论:ABO基因7号外显子743G>C为1个新的突变点,发现1个ABO新等位基因O61。
- 陶苏丹和艳敏应燕玲洪小珍许先国朱发明吕杭军严力行
- 关键词：ABO基因测序
- 中国人罕见的cisAB变异型分子机制分析被引量：40
- 2008年
- 为研究中国人群ABO血型系统中罕见的cisAB变异型的分子遗传背景,用血型血清学方法鉴定12例ABO血型疑难样本和116例随机无血缘关系样本,应用聚合酶链反应和DNA序列分析等方法对样本ABO基因酶活性编码区外显子6、7和侧翼内含子进行突变筛选和检测,并对不同基因型的扩增片段进行单倍体序列分析。血清学检测发现12个样本均为(A强B弱)或(A弱B强),PCR产物直接序列分析表明这些样本均为cisAB变异型,并存在4种基因型。通过单倍体序列分析,从中发现2种cisAB等位基因,其中cisAB01不仅存在外显子7的467C>T和803G>C变异,还在第6内含子存在未经报道的163T>C和179C>T变异;另一种等位基因是在B101基础上保留了A101的803G位点,编码一条176G、235S、266M和268G组合的多肽链。经检索,未发现该组合的ABO等位基因,该等位基因已被国际血型抗原基因突变数据库命名为cisAB05等位基因。文章系统研究了中国人群cisAB变异型分子机制,发现了一种新的cisAB05等位基因,同时根据内含子序列推测cisAB01等位基因可能是通过A101和B101等位基因间的同源交换而形成的。
- 许先国刘瑛洪小珍马开荣朱发明吕杭军严力行
- 关键词：分子机制ABO血型系统
- 高效液相色谱法测定α1,2岩藻糖基转移酶活性
- 2011年
- 目的:利用反相高效液相色谱技术建立α-1,2岩藻糖基转移酶活性的测定方法。方法:反应混合物处理后进样,以90%的20 mmol/L KH2PO4(含5%四丁基溴化铵)和10%甲醇为流动相,254 nm波长下检测底物β-苯酰半乳糖苷的减少量。结果:方法回收率≥97%,变异系数为1.66%,准确度和精密度都较高。β-苯酰半乳糖苷峰单一,无其它杂峰干扰。反应管与对照管相比,β-苯酰半乳糖含量明显降低。结论:建立的反相高效液相色谱法测定α-1,2岩藻糖基转移酶方法可靠,适合于常规检测和体外表达研究。
- 陶苏丹应燕玲和艳敏洪小珍许先国朱发明吕杭军严力行
- 关键词：反相高效液相色谱活性测定
- 一例ABO亚型ABx09的撒物学研究和鉴定被引量：19
- 2011年
- 目的研究1例ABO亚型ABx09的分子机制。方法应用单克隆抗体检测先证者红细胞AB0血型抗原，标准A、B、0红细胞检测先证者血清中的ABO抗体，采用聚合酶链反应（polymerase chainrea ction，PCR）技术分别扩增先证者ABO基因的第1～7外显子序列，PCR产物经酶切后直接测序分析。第5～7外显子扩增产物经TOPOTA克隆到质粒载体中获得单链，对所得克隆进行AB0基因第5～7外显子双向测序分析。家系调查采集先证者父母的标本进行血型血清学实验和ABO基因第6和7外显子直接测序分析。结果先证者红细胞有A、B抗原，同时血清中存在抗B抗体。直接测序分析发现第6外显子第261位无缺失、第297位AG，第7外显子467CT、526CG、657CT、703GA、796CA、803GC、889GA、930GA杂合，可指定为A102Bx09基因型。克隆测序得到两个等位基因A102和Bx09。与B101序列相比，Bx09第889位G—A，导致第297位谷氨酸变成赖氨酸。家系调查显示先证者Bx09等位基因从母亲遗传所得。结论α-1，3-半乳糖基转移酶基因第889位G—A突变导致产生Bx09表型，其血清中可含有抗B抗体。
- 洪小珍应燕玲许先国马开荣兰小飞刘瑛朱发明吕杭军严力行
- 关键词：ABO基因抗B抗体
- α-1,2岩藻糖基转移酶基因35C>T和682A>G突变点体外表达的研究被引量：1
- 2010年
- 本研究探讨35C>T和682A>G突变点对α-1,2岩藻糖基转移酶(FUT1)表达活性的影响。PCR扩增FUT1全长编码序列DNA片段,通过TOPOTA技术连接至表达载体pcDNA3.1/V5-His,获取目的重组质粒。采用脂质体转染方法将重组质粒转染COS-7细胞,经G418筛选培养后,利用流式细胞术分析细胞表面H抗原,实时荧光PCR检测fut1 mRNA表达情况。结果表明:成功获取了35T、682G+35T和682A+35C重组质粒。转染2天后H抗原在COS-7细胞膜上表达,第4天达最高峰。与野生型(682A+35C)转染的细胞相比,第4天重组质粒(682G+35T)转染细胞H抗原的表达量仅为野生型的13.3%,而重组质粒35T转染细胞为野生型的52.7%。转染后fut1mRNA水平随着时间延长而逐渐递减,在第1天重组质粒(682G+35T)转染细胞fut1 mRNA水平仅为野生型(682A+35C)的14%。结论:682A>G突变明显降低α-1,2岩藻糖基转移酶活性,而35C>T引起H抗原的表达部分下降。
- 和艳敏洪小珍马开荣蓝小飞许先国朱发明吕杭军严力行
- 关键词：H抗原类孟买型
- 10例类孟买表型α1,2岩藻糖基转移酶基因序列分析被引量：12
- 2011年
- 目的:分析10例类孟买血型表型的α1,2岩藻糖基转移酶基因序列情况。方法:ABO、H抗原检测采用血清学方法,利用PCR技术扩增FUT1编码区序列,PCR产物双酶切后直接测序分析。杂合子突变标本采用TOPO TA技术分离得到单链。结果:类孟买血型表型红细胞缺乏H抗原,与抗H试剂不凝集。10例标本直接测定FUT1基因编码区序列,3例为第547-552位AG两碱基缺失(CAGAGAG→CAGAG)纯合子,其它7例为有不同突变点的杂合子。单体型分析显示存在235C、293T、547-552delAG、658T、35T+682G、880-882delTT等6种单体型。结论:类孟买血型存在多种分子遗传机制,最常见单体型为547-552delAG。
- 洪小珍马开荣蓝小飞刘瑛许先国朱发明吕杭军严力行
- 关键词：类孟买型FUT1基因
- 双碱基缺失型等位基因复合杂合导致的类孟买型个体1例被引量：5
- 2011年
- 本研究探索1例类孟买型血型的分子机制,为稀有血型的筛选和鉴定提供理论基础。以血型血清学方法鉴定该个体红细胞的ABO和H表型,利用聚合酶链反应扩增类孟买表型个体的abo基因第6、7外显子和α1,2岩藻糖基转移酶基因(fut1)编码区,并对PCR产物直接测序分析。对纯化的fut1扩增产物进行TOPO克隆和测序,对2处变异位点进行单倍体序列分析。结果表明:血清学分析确认该个体为罕见的类孟买表型;直接测序发现先证者fut1基因第547位和880位附近存在碱基缺失或插入变异;TOPO克隆测序法证实,fut1基因1条单倍体存在第547-552位两碱基AG缺失,另1条单倍体存在880-882位两碱基TT缺失。这2种变异均导致移码突变,并提前形成终止密码。结论:在献血人群中发现1例罕见的类孟买表型,其分子机制为双碱基缺失型fut1等位基因复合杂合所致的α1,2岩藻糖基转移酶活性减弱。
- 马开荣陶苏丹蓝小飞洪小珍许先国朱发明吕杭军严力行
- 关键词：类孟买型
- α-1，2岩藻糖基转移酶基因293C〉T和658C〉T突变真核细胞稳定表达的研究被引量：4
- 2011年
- 目的建立α-1，2岩藻糖基转移酶基因（α-1，2-fucosyltransferase gene，FUT1）293C〉T和658C〉T突变真核表达细胞，阐明FUT1突变引起H抗原减弱的机制。方法抽提类孟买型先证者基因组DNA扩增FUT1全长编码序列，扩增片段与真核表达载体peDNA3．1连接构建重组表达质粒。采用脂质转染技术将重组质粒转染COS7细胞并进行稳定表达筛选。采用实时荧光定量PCR检测mRNA表达量，应用HPLC检测酶活性，采用十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel eieetrophoresis，SDS-PAGE）和Western印迹技术鉴定蛋白。结果构建了pcDNA3．1-FUT1野生型、pcDNA3．1-FUT1293C〉T、pcDNA3．1-FUT1658C〉T真核表达重组质粒，转染后通过G418筛选获得了稳定表达FUTj的COS7细胞。以野生型重组体转染细胞中FUT1mRNA量作为对照，293C〉T和658C〉T重组体转染细胞FUT1mRNA量分别为野生型的97．10％和104．74％。经SDS—PAGE电泳和Western印迹检测显示细胞表达相对分子质量约46000大小的目的蛋白片段，pcDNA3．1-FUT1野生型重组体转染细胞表达蛋白可催化相应的酶促反应，而peDNA3．1-FUT1293C〉T、pcDNA3．1-FUT1658C〉T转染细胞蛋白完全失去酶活性。结论体外实验提示293C〉T和658C〉T突变并不影响FUT1mRNA转录和蛋白生成，但表达蛋白的酶活性明显下降，从而导致H抗原生成减弱。
- 陶苏丹和艳敏洪小珍应燕玲朱发明吕杭军严力行
- 关键词：类孟买型基因突变酶活性
- B（A）血型分子机制研究及其家系分析被引量：15
- 2010年
- 目的研究罕见B（A）血型的血清学特性和分子机制，为B（A）血型的临床输血提供理论基础。方法利用单克隆抗体检测1例先证者、家系成员及献血者红细胞ABO血型抗原，用标准A、B、O红细胞检测其血清中的ABO抗体。采用盐水法、凝聚胺法和抗球蛋白法进行先证者与献血者交叉配合试验。采用PCR技术扩增ABO基因的第6、7外显子序列，对先证者、家系成员、献血者标本的ABO基因外显子6、7和侧翼内含子序列进行测序分析，并对先证者标本进行单倍体序列分析。结果先证者及其2位家系成员红细胞上有A、B抗原，同时血清中存在抗A1抗体，血清学表型为A2B。直接测序分析发现先证者标本第6、7外显子存在261G／del、297A／G、526C／G、657C／T、700C／G、703A／G、796A／C、803G／C、930A／G杂合，可推断为B（A）02／O01基因型杂合子；家系中其母亲基因型为B（A）02／B101，外祖母为B（A）02／O01.先证者单倍体序列分析得到2个等位基因B（A）02：和O01；与B101序列相比，B（A）02第700位C〉G，导致1个氨基酸改变：第234位脯氨酸变成丙氨酸。既往血清学特性为A：B的2个献血者，1个基因型为B（A）02／O01，另1个基因型是A208／B101.B（A）血型先证者与这2名献血者进行交叉配血试验均相合，临床输注后无不良反应。结论α-1，3-半乳糖基转移酶等位基因（B等位基因）700C〉G突变可导致形成B（A）血型，其血清学特性显示为A2B表型。B（A）血型临床输血相配合的供者可选择A，B表型的献血者。
- 洪小珍许先国马开荣兰小飞朱发明严力行
- 关键词：ABO血型系统血型不合系谱
