国家自然科学基金(30772016)
- 作品数：7 被引量：7H指数：2
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- 基因芯片筛查亚溶解型C5b-9刺激大鼠肾小球系膜细胞基因表达差异的研究
- 2011年
- 目的:应用高通量的基因芯片技术筛查亚溶解型C5b-9(sublytic C5b-9)介导大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesan-gial cells,GMCs)的基因表达谱的变化。方法:体外分离、培养大鼠GMCs,人工质控sublytic C5b-9复合物的形成,并用其刺激培养GMCs,然后分别提取sublytic C5b-9刺激GMCs 40 min、3 h及未刺激对照组细胞的总RNA。经逆转录合成生物素标记的cDNA探针,然后与基因芯片杂交(涵盖31 000个转录本,代表28 000个基因)。经Affymetrix Scanner 3000扫描芯片荧光信号图像、GCOS1.4读取数据后将差异表达基因注释于GO基因功能分类体系,分析其相应的功能。结果:芯片检查数据显示,sublytic C5b-9刺激GMCs 40 min时上调2倍以上及下调2倍以上的基因分别为4 124个和2 234个,刺激3 h时上调2倍以上及下调2倍以上的基因分别为4 512个和2 859个;而sublytic C5b-9刺激GMCs 40 min和3 h后同时上调2倍以上及下调2倍以上的基因分别为2 325个和1 419个。sublytic C5b-9刺激GMCs表达差异基因其功能主要涉及生物学过程调节、生物调节、定位相关、刺激应答、生长发育、增殖、代谢过程、细胞生理过程、多细胞机体过程等。结论:Sublytic C5b-9刺激GMCs确能引起基因表达谱的变化。
- 周颖邱文夏梅周建博李妍赵聃王迎伟
- 关键词：肾小球系膜细胞基因芯片
- 大鼠激活转录因子3单克隆抗体的制备和鉴定
- 2011年
- 目的制备特异性识别大鼠激活转录因子3(ATF3)的单克隆抗体(mAb)。方法根据软件预测的结果合成偶联有匙孔绒血蓝蛋白(key holeli mpet hemocyanin,KLH)的大鼠ATF3第168-181位氨基酸多肽。随后免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备抗大鼠ATF3的mAb。采用快速定性试纸法鉴定该单克隆抗体的亚型和亚类;通过ELISA、Western blot和免疫组织化学法鉴定单克隆抗体的特性。结果获得一株可稳定分泌抗大鼠ATF3 mAb的杂交瘤细胞,其分泌的ATF3单抗的亚型是IgG1,轻链为κ链。Western blot结果显示,该单抗能够特异性识别大鼠细胞内表达的ATF3蛋白。免疫组织化学检测结果表明,在Thy-1肾炎(Thy-1N)大鼠肾细胞胞质及细胞核内均有ATF3表达,但细胞核内的表达量较为显著。结论成功制备了一株抗大鼠ATF3的mAb,为进一步研究ATF3的生物学功能提供了可用的实验材料。
- 夏梅任琎蒋青桃李妍唐小军邱文赵聃王迎伟
- 关键词：单克隆抗体杂交瘤细胞WESTERNBLOTTHY-1肾炎
- 眼镜蛇毒因子耗竭补体对大鼠Thy-1肾炎凋亡病变及其Gadd45α基因表达的影响被引量：1
- 2008年
- 目的:研究眼镜蛇毒因子(CVF)耗竭体内补体对Thy-1肾炎大鼠肾小球系膜细胞(GMCs)凋亡病变及其生长阻滞和DNA损伤诱生蛋白45α(Gadd45α)基因表达的影响。方法:利用抗胸腺细胞抗血清(ATS)复制大鼠Thy-1肾炎(Thy-1 N)模型。大鼠随机分为正常对照组、Thy-1 N组和CVF+Thy-1 N组。取各组大鼠血清检测补体CH50活性。另取各组大鼠肾皮质,行电镜和TUNEL染色检查判断其肾组织细胞凋亡的病理变化;用RT-PCR和real-time PCR检测大鼠肾组织凋亡相关基因,即Gadd45α mRNA丰度;用Western blotting检测Gadd45α蛋白表达水平。结果:CVF+Thy-1 N组补体CH50活性明显下降,与Thy-1 N组和正常对照组相比差异明显(P<0.01)。电镜和TUNEL染色观察到Thy-1 N组大鼠GMCs有凋亡病变,而CVF+Thy-1 N组凋亡病变则显著减轻。Thy-1 N组大鼠肾皮质Gadd45α mRNA 40min开始上调,3h达到峰值,而用CVF处理的Thy-1 N大鼠,Gadd45α mRNA丰度则明显低于Thy-1N组(P<0.01);Thy-1 N组Gadd45α蛋白水平3h时显著增多,而CVF+Thy-1 N Gadd45α蛋白水平明显低于Thy-1 N组(P<0.01)。结论:CVF耗竭补体可显著减轻大鼠Thy-1肾炎凋亡病变并抑制Gadd45α基因的表达。
- 冯雪凤邱文高玲娟张艳王迎伟
- 关键词：补体THY-1肾炎肾小球系膜细胞凋亡
- 大鼠野生型Gadd45γ基因和Gadd45γshRNA真核表达质粒的构建及鉴定被引量：1
- 2009年
- 目的:构建大鼠野生型Gadd45γ基因和其特异性短发卡状小干涉RNA(shRNA)真核表达质粒,并观察其在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中过表达及沉默Gadd45γ基因的情况。方法:用DNA重组技术将针对大鼠Gadd45γ基因的cds区序列或针对其不同位点所设计的4对shRNA序列分别克隆到真核表达质粒pcDNA3.1/HA或pGCsi.U6.neo.GFP中。在酶切分析及序列测定正确后,用GenEscortTMⅢ转染试剂将上述两种质粒分别转染至大鼠GMCs中,用免疫细胞化学和Western blot检测HA-Gadd45γ融合蛋白的表达及筛选最佳沉默效率的shRNA。结果:限制性酶切及核酸序列分析证明两种重组质粒均构建正确。免疫细胞化学和Western blot分析表明构建的pcDNA3.1/Gadd45γ质粒在大鼠GMCs中能够表达;Gadd45γshRNA-3具有最佳沉默效率。结论:成功构建了大鼠野生型Gadd45γ基因和其特异性的shRNA真核表达质粒,该实验结果为进一步研究Gadd45γ基因的生物学功能奠定了基础。
- 车楠邱文夏梅赵聃王迎伟
- 关键词：SHRNA肾小球系膜细胞
- 大鼠ATF3基因shRNA真核表达质粒的构建及鉴定
- 2009年
- 目的:构建针对大鼠ATF3(activating transcription factor3,ATF3)基因的特异性短发卡RNA(small hairpinRNA,sh RNA)真核表达质粒。方法:用DNA重组技术将针对大鼠ATF3基因不同位点所设计的5个shRNA序列克隆到真核表达质粒pGenesil-1中。在酶切分析及序列测定后,用脂质体将5个shRNA分别转染至大鼠肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cells,GMC),随后用Western blot检测蛋白的相对表达量来筛选最佳沉默效率的shRNA。结果:限制性酶切及核酸序列分析证明重组质粒构建正确。Western blot证实在重组质粒中,shATF3-1具有最佳的沉默效率。结论:成功构建了针对ATF3基因的shRNA的真核表达质粒,并且该shRNA可以特异性地降低大鼠肾小球系膜细胞ATF3的蛋白表达。
- 任琎姜孝明夏梅赵聃王迎伟
- 关键词：ATF3SHRNA肾小球系膜细胞
- 大鼠野生型Egr-1基因及Egr-1 shRNA真核表达质粒的构建及鉴定被引量：2
- 2010年
- 目的:构建大鼠野生型早期生长应答基因-1(early growth responsegene-1,Egr-1)及其特异性短发夹状小干涉RNA(shRNA)真核表达质粒,并观察Egr-1在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中过表达及沉默Egr-1基因的情况。方法:用DNA重组技术将针对大鼠Egr-1基因的CDS区序列和针对其不同位点所设计的3对shRNA序列分别克隆到真核表达质粒pcDNA3.1-myc-his-A和pGCsi.U6.neo.GFP中。经酶切分析及序列测定正确后,用GenEscortTMⅢ转染试剂将上述两种质粒分别转染至大鼠GMC中,随后进行Western blot检测Egr-1蛋白的表达及筛选最佳沉默效率的shRNA。结果:限制性内切酶酶切及核酸序列分析证明,两种重组质粒均构建正确。Westernblot分析表明,构建的pcDNA3.1/Egr-1质粒在大鼠GMC中能够表达;Egr-1shRNA-2具有最佳沉默效率。结论:成功构建了大鼠野生型Egr-1基因和其特异性的shRNA真核表达质粒,为进一步研究Egr-1基因的生物学功能提供了必要的实验工具。
- 刘炘刘丽莎邱文夏梅王迎伟
- 关键词：肾小球系膜细胞
- 大鼠野生型IRF-1基因和IRF-1 shRNA真核表达质粒的构建及鉴定被引量：4
- 2010年
- 目的:构建大鼠野生型干扰素调节因子1(interferon regulatory factor-1,IRF-1)基因及其特异性短发夹状小干涉RNA(shRNA)真核表达质粒,并观察IRF-1在大鼠肾小球系膜细胞(GMC)中过表达及沉默IRF-1基因的情况。方法:用DNA重组技术将针对大鼠IRF-1基因的CDS区序列和针对其不同位点所设计的3种shRNA序列分别克隆到pcDNA3.1及pGCsi.U6.neo.GFP真核表达质粒中。在酶切鉴定及序列测定正确后,用GenEscortTMⅢ转染试剂将上述两种质粒分别转染入培养的大鼠GMC中,然后用Western blot检查IRF-1融合蛋白的表达,同时筛选最佳沉默效率的shRNA。结果:限制性酶切及核酸序列分析证明,两种重组质粒均构建成功。Western blot证实构建的pcDNA3.1/IRF-1质粒在大鼠GMC中能正确表达,且IRF-1shRNA-2具有最佳沉默效率。结论:本实验成功构建了大鼠野生型IRF-1及其特异性的shRNA真核表达质粒,为进一步研究IRF-1基因的生物学功能提供了必要的实验材料。
- 刘丽莎刘炘邱文夏梅王迎伟
- 关键词：干扰素调节因子-1小发夹RNA肾小球系膜细胞
