国家自然科学基金(30600270)
- 作品数：4 被引量：14H指数：3
- 相关作者：李波方文刚陈誉华王淳赵晓云更多>>
- 相关机构：中国医科大学辽宁中医药大学沈阳药科大学更多>>
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- 相关领域：医药卫生更多>>
- 利用腺病毒载体介导的RNA干扰技术在悬浮细胞中获得基因沉默效应
- 2012年
- 目的利用重组腺病毒载体携带短发夹RNA(shRNA),使难于转染的悬浮细胞达到较高的目的基因沉默效率。方法分别将含有人胎盘生长因子(PLGF)的干扰序列及阴性对照序列(scramble)连入pRNAT-H1.1/Adeno载体,获得重组穿梭质粒;将线性化的重组穿梭质粒与腺病毒骨架重组;将重组子转染HEK 293细胞,经过3轮病毒包装,收获病毒颗粒并测定滴度。病毒颗粒感染悬浮细胞——人小细胞肺癌细胞(NCI-H 250和NCI-H 209),通过实时定量PCR方法鉴定靶基因沉默效应,并利用肿瘤细胞重建基质膜侵袭实验进行功能鉴定。结果成功构建带有靶基因干扰序列及scramble、空载体的3种腺病毒重组子(AD-shuttle-shPLGF、AD-shuttle-scramble和AD-shuttle)。经过HEK 293细胞包装,最终获得3株病毒颗粒,病毒滴度分别为1.5×1011、1.6×1011和1.6×1011。NCI-H 250和NCI-H 209细胞感染腺病毒颗粒48 h后,大部分细胞表达GFP,感染率接近100%;且两株细胞感染AD-shuttle-shPLGF病毒48 h后,PLGF mRNA表达水平降低(P<0.01),肿瘤细胞侵袭能力明显下降(P<0.01)。结论携带shRNA的腺病毒表达载体可以代替电转、脂质体介导等方法,使难于转染细胞的目的基因达到有效沉默。
- 王淳方文刚李波
- 关键词：RNA干扰SHRNA腺病毒载体悬浮细胞
- 小细胞肺癌细胞诱发人脑微血管内皮细胞紧密连接的开放被引量：5
- 2009年
- 目的小细胞肺癌易发生脑转移,但其机制尚不完全清楚,本文探讨小细胞肺癌细胞对人脑微血管内皮细胞单层细胞间紧密连接开放的作用。方法应用免疫荧光技术观察人脑微血管内皮细胞间紧密连接结构改变;应用Western blot技术分析小细胞肺癌细胞与微血管内皮细胞单层共培养时紧密连接蛋白occludin的可溶性片段和不可溶性片段在内皮细胞紧密连接处的分布情况;应用跨内皮迁移实验及辣根过氧化物酶渗漏实验分析小细胞肺癌细胞与内皮细胞单层共培养后其跨内皮细胞单层的迁移能力和内皮单层渗透性的改变;利用ROCK特异性抑制剂Y27632,分析Rho/ROCK信号通路是否参与小细胞肺癌细胞跨内皮单层迁移。结果小细胞肺癌细胞能够通过人脑微血管内皮细胞单层迁移,在0h到12h之间随培养时间的延长小细胞肺癌细胞的迁移率逐渐增加;共培养8h时人脑微血管内皮细胞紧密连接处紧密连接结构蛋白(ZO-1和occludin)表达减少,通透性明显增加;ROCK特异性抑制剂Y27632能够阻断小细胞肺癌细胞引起的内皮细胞间紧密连接处紧密连接结构蛋白ZO-1和occludin表达减少、内皮单层通透性的增加及小细胞肺癌细胞跨内皮单层迁移。结论小细胞肺癌细胞与人脑微血管内皮细胞单层共培养诱发人脑微血管内皮细胞间紧密连接的开放,利于小细胞肺癌细胞的跨内皮单层迁移。
- 赵晓云李波曹立业方文刚朱莉陈誉华
- 关键词：小细胞肺癌细胞人脑微血管内皮细胞共培养
- PLGF通过激活Rho/ROCK信号通路介导人脑微血管内皮细胞间紧密连接开放被引量：6
- 2013年
- 目的探讨胎盘生长因子(PLGF)影响人脑微血管内皮细胞(HBMEC)间通透性的分子机制。方法利用HBMEC构建体外血脑屏障模型,测定跨内皮细胞电阻抗(TEER)及检测HRP通过率,分析PLGF对血脑屏障完整性的影响;用Western blot法及免疫荧光法检测HBMEC间紧密连接相关蛋白质occludin和ZO-1的表达及分布,用蛋白激酶抑制剂干预和Western blot法检测Rho蛋白活性。结果 25 ng/mL PLGF 30 min显著降低体外血脑屏障模型TEER,使其通透性增高(P<0.05);增加S-occludin表达的同时降低了IS-occludin的表达,使ZO-1蛋白在细胞周边分布减少;此外,ROCK蛋白激酶抑制剂Y27632抑制了PLGF引起的体外血脑屏障透过性增高(P<0.05),并激活细胞内Rho激酶活性。结论 PLGF通过激活HBMEC内Rho/ROCK信号通路,影响HBMEC间紧密连接完整性,进而改变血脑屏障的通透性。
- 王淳李波方文刚陈誉华
- 关键词：胎盘生长因子RHOROCK
- 肺硬化性血管瘤临床病理特点及免疫表型分析被引量：3
- 2009年
- 目的回顾性分析40例肺硬化性血管瘤的临床病理及免疫表型特点。方法免疫组织化学S-P法检测CK(Pan)、CK(H)、CK(L)、EMA、TTF-1、Syn、CgA、NSE、CR、MC、CD34、Vim。结果女性33例,右肺25例,右肺下叶15例,左肺下叶11例。立方形细胞和圆形细胞构成乳头状、实性区、硬化区、出血区4种相互移行的组织结构,乳头状结构最常见,出血性结构最少见。表面立方形细胞表达EMA、CK(Pan)、TTF-1,间质内圆形细胞表达EMA、TTF-1、Vim;两种细胞均无间皮及血管内皮标记的表达,个别病例两种细胞不同程度散在表达Syn、NSE、CgA。结论立方形与多角形细胞均为肿瘤细胞,免疫表型具有异质性,表现不同的分化程度。
- 黄波李妍李强陈莉李波
- 关键词：肺硬化性血管瘤临床病理免疫表型
