国家自然科学基金(30971293)
- 作品数：1 被引量：1H指数：1
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- 斑马鱼jak2a载体构建及其对红系造血功能影响的初步研究被引量：1
- 2013年
- 目的构建jak2a野生型(wilde type,wt)载体并完成其在斑马鱼体内的过表达,运用邻联茴香胺染色观察其对红系造血的影响,为后续探讨斑马鱼骨髓增殖性疾病(myeloproliferative disorders,MPD)模型的Jak/Stat信号通路奠定基础。方法根据jak2a基因GenBank NM_131093序列V581F突变位点上下游序列设计引物,以pGM-T-jak2a V581F质粒载体为模板进行PCR后,用DpnⅠ酶对产物进行消化去除模板,转化感受态细菌DH5α,通过蓝白筛选酶切鉴定阳性菌落,小量提取质粒,NdeⅠ限制性内切酶线性化pGM-T-jak2a-wt质粒,运用T7Transcript Aid酶对jak2a基因进行体外转录及加帽。经凝胶电泳对目的片段进行鉴定。以200ng/μL浓度jak2a-wt mRNA加帽产物显微注射斑马鱼单胞期受精卵,运用邻联茴香胺染色检测其对红系增殖的影响。结果完成pGM-T-jak2aV581F的定点突变,成功构建pGM-T-jak2a-wt载体,DNA序列分析的结果与GenBank上的序列(NM_131093)一致,酶切线性化及体外转录加帽pGM-T-jak2a-wt,凝胶电泳鉴定RNA分子大小与预期完全一致。对过表达jak2a的鱼卵进行邻联茴香胺染色,发现斑马鱼卵黄囊及ICM区红细胞明显增多。结论成功完成斑马鱼pGM-T-jak2aV581F基因定点突变并体外转录及加帽pGM-T-jak2a-wt,体内过表达jak2a对红系发生有显著影响。
- 朱贤敏姜利军赵磊关军肖湘慧张义成
- 关键词：定点突变体外转录
