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木薯MeAHL31基因克隆及其在原核细胞中的表达与优化被引量：1: 2019年; AT-hook是一类含有AT-hook基序的核定位蛋白,被命名为AHL蛋白(AT-hook nuclear localized proteins),在植物生长发育、器官建成以及对激素信号和逆境胁迫响应中起重要作用。本研究通过RT-PCR克隆获得木薯MeAHL31基因,全长为1 189 bp,其中开放阅读框(ORF)为1 014 bp,编码337个氨基酸,蛋白质分子量为35.69 k D,理论等电点为5.55,GRAVY为-0.74,是一个不稳定的亲水性蛋白,在128～264 aa区间存在一个AT-hook蛋白的保守结构域PPC domain,属于AT-hook蛋白家族。我们分别将全长MeAHL31(1～1 014)和MeAHL31 (370～742)基因片段构建到pET28a原核表达载体和含麦芽糖结合蛋白(maltose binding protein, MBP)标签的pET28a-MBP载体上,并转化至E. coli BL21 (DE3)中进行诱导表达和表达条件优化。结果表明,最佳诱导表达条件是OD600=0.6,IPTG浓度为1.0 mmol/L,15℃培养16 h;含MBP融合伴侣的pET28a-MBP载体更有利于Me AHL31蛋白的可溶性表达;在同种载体中预测可溶性高的MeAHL31(370～742)区段序列较MeAHL31 (1～1 014)全长基因的可溶性蛋白表达水平更高。本研究优化高效诱导表达条件获得MeAHL31融合蛋白,为探究MeAHL31基因的生物学功能提供理论依据。; 王元元刘姣王硕符少萍李瑞梅姚远胡新文郭建春; 关键词：木薯 AT-HOOK 基因克隆原核表达

木薯MeCREB基因的分子克隆及其在原核细胞中的表达和优化被引量：3: 2018年; 本研究以木薯为材料,通过RT-PCR克隆出了MeCREB基因,核酸序列分析表明,所克隆的基因与phytozome数据库收录的MeCREB基因(Manes.04G058300.1)序列基本一致。MeCREB基因全长968 bp,其中开放性阅读框(ORF)为747 bp,编码248个氨基酸,预测得出MeCREB蛋白是一个不稳定的亲水性蛋白,编码蛋白质的分子量为26.26 kD,理论等电点为5.99,GRAVY为-0.667。构建MeCREB-pGEX-6p-1表达载体,在大肠杆菌中进行诱导表达,并对影响重组蛋白表达的4个主要因素(诱导温度,诱导起始菌量,IPTG浓度及诱导时间)进行优化,确定GST-MeCREB融合蛋白的最适表达条件。结果表明:重组工程菌生长至OD600=0.8时加入终浓度为0.1 mmol/L的IPTG,在28℃下诱导6 h,最适合GST-MeCREB融合蛋白的表达。本研究为高效诱导获得GST-MeCREB融合蛋白用于下游实验提供了最优方案,并为进一步研究MeCREB基因的生物学功能奠定了基础。; 王硕刘姣符少萍段瑞军李瑞梅姚远胡新文郭建春; 关键词：木薯基因克隆原核表达

木薯MeCWINV4启动子的克隆及其活性分析: 2016年; 根据木薯细胞壁转化酶基因MeCWINV4已知编码区序列与木薯基因组数据库中预测的MeCWINV4基因序列信息设计引物,从木薯基因组DNA中对该基因的潜在启动子区进行PCR扩增,经测序比对成功获得1 639 bp序列,其中包含74 bp编码区序列和1 565 bp潜在启动子区序列。用Plant CARE和PLACE软件分析该序列的顺式作用元件,发现该启动子包含CAAT box和TATA box保守元件、大量光反应相关元件与应对高低温胁迫和激素响应相关元件。将MeCWINV4启动子片段取代pVKH表达载体中的CaMV 35S启动子与GUS连接,构建成融合表达载体pVKH-CW4-GUS,通过农杆菌真空渗透法在烟草叶片中进行瞬时表达。结果表明,该启动子驱动了GUS基因在烟草叶片中的表达。说明MeCWINV4启动子具有启动子活性,可以启动目的基因的转录,为进一步研究该基因的调控机制奠定了基础。; 耿彬彬刘姣郭育强符少萍胡新文郭建春; 关键词：木薯启动子

MeCWINV6酵母单杂交文库构建及其调控基因筛选被引量：8: 2016年; MeCWINV6是木薯6个细胞壁转化酶基因之一。本研究中应用酵母单杂交技术筛选MeCWINV6启动子的上游转录调节因子,为进一步研究该基因的表达调控提供基础。由MeCWINV6的启动子构建诱饵融合载体,转化酵母细胞构建诱饵菌株。运用SMART技术构建木薯酵母单杂交c DNA文库,再共转化诱饵菌株,经同源重组筛选MeCWINV6启动子的上游转录调节因子。构建的c DNA文库库容为7.08×106,插入片段大小在250~2 000 bp间。筛选大于1 000 bp的35个阳性克隆,经测序和Blast同源性分析筛选出锌指蛋白、组氨酸蛋白H1.2和AT-hook核定位蛋白三个转录因子以及一个线粒体受体TOM5。为进一步研究MeCWINV6基因的表达调控机制提供了候选转录因子。; 郭育强刘姣符少萍段瑞军李瑞梅姚远胡新文郭建春; 关键词：SMART技术 DNA文库

AT-hook蛋白的最新研究进展被引量：2: 2020年; AT-hook是一类新的DNA结合蛋白基序,与其他功能已知的DNA结合蛋白基序不同。AT-hook蛋白具有AT-hook基序和PPC(plants and prokaryotes conserved domain,DUF296)两个特殊功能域。AT-hook广泛存在于不同物种的DNA结合蛋白中,在植物生长发育、器官构建、逆境胁迫和激素信号应答中发挥重要的调节作用;对基因克隆、细胞间特异性结合、染色体结构调节以及转录因子调节具有重要的调控作用。通过调节AT-hook蛋白进而改变生物某些不理想的生理生化调控通路,提高生物某些优良性状具有重要研究价值及意义。本综述主要从AT-hook蛋白的结构特征、分类及其依据、功能调节机制、生物学功能以及研究价值等方面进行相关阐述及总结。; 王元元刘姣郭育强王硕符少萍段瑞军李瑞梅姚远胡新文郭建春

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国家自然科学基金(31371706)