江苏省科技攻关计划(BE2007342)
- 作品数：7 被引量：18H指数：3
- 相关作者：李玉峰姜平王先炜杜以军李军星更多>>
- 相关机构：南京农业大学河北农业大学更多>>
- 发文基金：国家教育部博士点基金江苏省科技攻关计划国家科技支撑计划更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 猪脑心肌炎病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒二重RT-PCR检测方法的建立被引量：2
- 2009年
- 根据猪脑心肌炎病毒(EMCV)3D基因和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白基因序列设计合成了两对特异性引物,经过PCR反应条件的优化,建立了EMCV和PRRSV二重RT-PCR方法,其PCR产物大小分别为286 bp和390 bp,并具有EMCV和PRRSV特征序列。该方法对EMCV和PRRSV的最低检测量分别为10×TC ID50和1×TC ID50;而对乙型脑炎病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒的PCR检测结果均为阴性;20份临床发病仔猪样品检测结果为PRRSV阳性者15份,EMCV阳性者3份,证明我国存在EMCV感染。该方法敏感、特异,可用于EMCV和PRRSV感染的检测。
- 白娟李广明宋勤叶李玉峰王先炜张国龙姜平
- 关键词：猪脑心肌炎病毒猪繁殖与呼吸综合征病毒
- 猪IL-10的原核表达及其单克隆抗体的制备被引量：2
- 2010年
- 为了制备猪IL-10的单克隆抗体(MAb),本研究根据GenBank登录的猪白细胞介素10(PIL-10)基因序列设计两对特异性引物,利用套式PCR扩增PIL-10成熟蛋白编码基因(490bp),构建原核表达载体pET28a-PIL-10,并转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导,SDS-PAGE和western blot分析鉴定,证明PIL-10重组蛋白获得表达。提取纯化该重组蛋白包涵体,免疫BALB/c小鼠,经过3次细胞融合,间接ELISA方法筛选,获得一株能稳定分泌抗猪IL-10MAb的杂交瘤细胞,将其命名为2F4。Western blot结果证明该MAb能够与重组蛋白发生特异性反应。间接ELISA测定细胞上清抗体效价为1∶1024,腹水效价为1∶128000,该MAb为IgG3亚型,轻链为λ型。杂交瘤细胞连续传代20代,分泌抗体的效价基本一致,从而为进一步建立猪IL-10的检测方法奠定了物质基础。
- 刘婷婷王兴龙李玉峰宋艳华张国龙姜平
- 关键词：原核表达单克隆抗体
- 重组腺病毒载体表达的α干扰素对猪繁殖与呼吸综合征病毒复制的抑制作用被引量：4
- 2009年
- 目的:研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)新的防治方法。方法:利用表达猪α干扰素的重组腺病毒(rAd-IFNα),通过病毒滴度、间接免疫荧光试验和实时定量RT-PCR检测,在Marc-145细胞上观察其对高致病性PRRSV SY0608株的复制抑制作用。结果:将rAd-IFNα接种细胞后24 h,再感染PRRSV,可以有效阻止PRRSV造成的细胞病变,PRRSV滴度和mRNA水平明显降低;该抑制作用随rAd-IFNα接种剂量的增加而增强,但随病毒培养时间延长而逐渐减弱。此外,将PRRSV感染细胞后24 h,再接种rAd-IFNα,仍可以有效降低PRRSV滴度和mRNA水平,并且rAd-IFNα对PRRSV传统毒株S1株同样具有明显的抑制作用。结论:rAd-IFNα可以有效抑制PRRSV在Marc-145细胞上复制,为PRRSV的防治提供了理论依据。
- 李广明李玉峰王先炜杜以军白娟姜平
- 关键词：重组腺病毒Α干扰素
- PRRSV NSP2基因在重组杆状病毒中的表达与鉴定
- 2009年
- 为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白2(NSP2)之间的差异和生物学特性,本研究根据PRRSV、S1、SY0608株NSP2基因序列保守区设计引物,通过RT-PCR扩增出两毒株的NSP2基因,克隆到pFastBacTMHTB杆状病毒载体中,将筛选的阳性重组载体pF-S1-NSP2和pF-SY-NSP2,分别转化至含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态大肠杆菌中,经蓝白菌落筛选和PCR鉴定,获得重组表达载体rBac-S1-NSP2和rBac-SY-NSP2。在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rAc-S1-NSP2和rAc-SY-NSP2,Westernblot和间接免疫荧光实验结果表明,本研究成功构建了表达PRRSVS1和SY0608株NSP2蛋白的重组杆状病毒,表达的蛋白与自然感染PRRSV的猪血清均具有良好的反应原性,为进一步研究NSP2蛋白的功能及生物学和免疫学特性奠定了基础。
- 宋艳华王海燕李文良李军星李玉峰王先炜姜平
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒NSP2杆状病毒
- 表达猪圆环病毒2型Cap和猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5融合蛋白重组腺病毒的构建和免疫原性测定被引量：3
- 2009年
- 断奶后多系统衰弱综合征(PMWS)是目前规模化猪场常见的传染病,由PCV2感染引起。临床上PCV2与PRRSV混合感染较常见,死亡率和发病率很高,但目前尚无能有效预防该病的商品化疫苗。本研究利用基因克隆方法,构建融合表达PCV2-Cap蛋白与PRRSV-GP5蛋白的重组腺病毒rAd-Cap-GP5,经IPMA、IFA和Western blotting验证了Cap蛋白和GP5蛋白在该重组病毒中获得表达。将该重组腺病毒免疫小鼠测定其抗体、中和抗体,结果显示小鼠免疫后出现两种病毒的抗体和中和抗体,诱导小鼠产生明显的体液免疫应答,可以作为预防PCV2-PRRSV混合感染的基因工程疫苗候选毒株,为PCV2和PRRSV二联重组亚单位疫苗的研究奠定了基础。
- 王先炜李玉峰姜平
- 关键词：猪圆环病毒2型猪繁殖与呼吸综合征病毒重组腺病毒
- 2株猪繁殖与呼吸综合征病毒毒株对仔猪致病性的比较被引量：1
- 2009年
- 为了比较最新分离的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)变异分离株SY0608和传统毒株S1对仔猪的致病性,本研究选择9头30日龄商品仔猪,随机分为2组,分别接种2株病毒,即S1株感染组(n=5头),SY0608株感染组(n=4头),接种后隔离饲养观察2周。经临床症状观察、病理学、病原学和血常规学检查,结果:SY0608毒株感染组仔猪表现明显临床症状,接种3 d后体温急剧升高至41.8℃;白细胞数急剧减少(降低了45%);病理学变化严重,肺泡膈增宽,大部分肺组织肺泡不张;而S1株感染组仔猪仅出现轻微临床症状和病理变化。SY0608毒株感染组仔猪病毒血症持续时间较S1毒株感染组长,病毒在脏器中的分布更为广泛。SY0608株感染组血清ELISA抗体水平明显高于S1株感染组。结果表明,SY0608毒株对仔猪致病作用明显强于S1毒株。
- 唐波姜平李玉峰洪伟彬王兴龙
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒非结构蛋白NSP2的原核表达及其单克隆抗体的制备被引量：6
- 2008年
- 将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)S1株截短修饰的NSP2蛋白基因(tNSP2),克隆于pGEX-6P-1载体中,转化大肠杆菌后用IPTG诱导表达。Western blot结果表明,融合表达的GST-tNSP2蛋白能被PRRSV阳性血清特异性识别,大小约50kDa。经GST柱提取纯化蛋白GST-tNSP2,免疫Balb/c小鼠,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,获得2株能稳定分泌抗NSP2蛋白抗体的杂交瘤细胞株,将其命名为2B5、3H3,亚型鉴定结果均为IgG1型,其轻链均为κ链。间接免疫荧光试验证明,2B5和3H3均能与PRRSV S1毒株产生特异性反应,而不能与SY0608毒株反应,从而为PRRSV分离株的鉴定及NSP2功能研究奠定了重要基础。
- 王海燕姜平杜以军李玉峰李军星沈芳
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒单克隆抗体原核表达
