国家自然科学基金(30170289)
- 作品数：7 被引量：9H指数：2
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- 相关机构：复旦大学附属肿瘤医院复旦大学上海医学院教育部更多>>
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- 辐射诱导Egr-1调控腺病毒介导Smad 7基因对Lewis肺癌生物学行为影响的在体研究
- 2005年
- 目的研究射线诱导下Egr-1基因启动子调控腺病毒介导的Smad 7基因在C57BL/6J小鼠Lewis肺癌原发病灶内表达后,对原发灶及远处肺转移发生的影响.方法将Egr-1基因启动子的辐射敏感元件和Smad7 cDNA包装到复制缺陷型腺病毒内,制备成AD.Egr-Smad 7.接种Lewis肺癌细胞于小鼠右后肢外侧,建立荷瘤小鼠模型,肿瘤直径达0.8～1.0 cm时进行实验.小鼠被随机分入空白对照、生理盐水(NS)对照、AD.Egr-Smad7对照、单纯照射、NS+照射、AD.Eg-Smad 7+照射组(6只/组),分别进行如下研究:(1)隔日记录肿瘤长径及短径,观察肿瘤生长曲线、生长延迟时间及小鼠生存时间;(2)观察肿瘤照射2周时肺转移发生情况;(3)观察肿瘤生长至照射时4倍体积时肺转移发生情况.结果放射线诱导Egr-1基因启动子调控腺病毒介导的Smad 7基因在C57BL小鼠Lewis肺癌原发病灶内表达后,有抑制原发肿瘤生长及延长小鼠生存时间的作用(P＜0.05),对肿瘤远处肺转移的发生无明显影响(P＞0.05).结论放射线诱导AD.Egr-Smad 7无促进小鼠Lewis肺癌肿瘤局部病灶发展及远处脏器转移的危险性,并且有抑制原发肿瘤生长及延长生存时间的作用.将AD.Egr-Smad 7用于阻断TGF-β信号传导通路,靶向性基因治疗放射性肺纤维化具有一定的安全性.
- 王丽冯炎傅小龙蔡旭伟
- 关键词：SMADLEWIS肺癌细胞SMAD7基因EGR-1
- AD.Egr-Smad7定向基因治疗放射性肺纤维化的体内实验研究被引量：2
- 2006年
- 目的通过体内实验研究，观察AD．Egr-Smad7防治C57BL小鼠放射性肺纤维化的疗效，探讨其作用机制。方法将Egr-1基因启动子的放射敏感元件和Smad7 cDNA包装到复制缺陷型腺病毒内，制备成AD．Egr-Smad7。288只小鼠随机分成6组，分别为空白对照组，单纯放射组（每日照射2次，每次8Gy，两次照射间隔8h）、AD．Egr-Smad7组，AD．Egr-Smad7放射组，病毒载体组，病毒载体放射组，各组又分为放射后0、1、2、4、8及12周小组，每小组小鼠8只。小鼠气管内给AD．Egr-Smad7、病毒载体，24h后单次全胸放射。用ELISA法检测肺组织内TGF-81、CTGF、Ⅰ型及Ⅲ型胶原含量；碱水解法测定羟脯氨酸含量；光镜下病理组织学做肺泡炎及肺纤维化镜下评分。结果γ射线照射激活Egr-1启动子调控腺病毒介导的外源性Smad7在C57BL小鼠肺内放射后1～4周内有降低TGF-B、Ⅰ型、Ⅲ型胶原及羟脯氨酸含量的作用，与对照组相比差异有统计学意义（均P〈0．01）；光镜下病理组织学改变及肺纤维化评分也证明放射激活Egr-1启动子调控外源性Smad7有降低放射后12周时肺纤维化的作用。结论放射前单次给药，经放射线诱导Egr-1启动子靶向性调控外源性Smad7基因表达，4周内在一定程度上存在阻断TGF-β信号传导通路的作用，12周时病理结果显示有定向阻断放射性肺纤维化的作用。但降低病毒载体的免疫源性及解决外源性基因持续作用问题需要进一步研究。
- 王丽冯炎傅小龙蔡旭伟
- 关键词：肺纤维化基因疗法SMAD7
- 放射线诱导Smad 7基因表达阻断放射性肺纤维化离体实验研究被引量：1
- 2005年
- 目的研究含Egr1基因启动子和Smad7cDNA的重组腺病毒在细胞水平表达Smad7蛋白,是否具有阻断转化生长因子β1(TGFβ1)信号传导通路从而阻断胶原合成的生物学活性。方法重组腺病毒感染成纤维细胞(3T6),经深部X线照射后通过免疫细胞化学方法检测Smad7蛋白在细胞内的表达定位。成纤维细胞再经TGFβ1刺激后通过3H胸腺嘧啶核苷(3HTdR)和3H脯氨酸(3HPro)结合法检测比较实验组和对照组细胞增殖能力和胶原合成情况,采用液体闪烁计数法测定每分钟闪烁计数(cpm)值进行定量比较。结果细胞免疫化学结果显示Smad7蛋白表达定位于细胞浆内。同位素3HPro检测结果显示实验组cpm值为3287,对照组cpm值为5690,两者差异有统计学意义(P=0.026)。空白组cpm值为3625,与实验组无差别(P=0.741),说明实验组成纤维细胞胶原合成量明显低于对照组,与基础水平相当。3HTdR检测结果显示各组间细胞增殖能力无明显差别(P=0.312)。结论通过重组腺病毒在成纤维细胞内表达的Smad7蛋白具有在细胞浆内阻断TGFβ1信号传导通路从而抑制胶原合成的生物学活性,其抑制胶原合成可能是在转录水平实现的。
- 蔡旭伟杨健宋后燕傅小龙
- 关键词：放射线SMAD7基因基因表达放射性肺纤维化离体实验
- 辐射诱导Egr-1调控腺病毒介导Smad 7基因在体表达的实验研究被引量：1
- 2005年
- 目的研究辐射诱导下Egr1基因启动子调控腺病毒介导的Smad7基因在C57BL小鼠肺内表达与放射剂量及放射后时相间的关系。方法将Egr1基因启动子的放射敏感元件和Smad7cDNA包装到复制缺陷型腺病毒内,制备成AD.EgrSmad7。小鼠气管内给AD.EgrSmad7,24h后单次全胸照射。324只小鼠随机分组进入实验,γ线8Gy照射后不同时间取肺组织测定Smad7蛋白含量,研究照射后Smad7基因肺内表达的时效关系。108只小鼠随机分组进入实验,以不同剂量照射后5h取肺组织测定Smad7蛋白含量,研究Smad7基因肺内表达与放射剂量的关系。采用Westernblot印迹法检测小鼠肺组织Smad7蛋白表达。结果γ线照射可明显诱导Egr1基因启动子调控腺病毒介导的Smad7基因在C57BL小鼠肺内表达,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.01)。Smad7基因表达量与照射剂量和照射后间隔时间有关,单次照射0～12Gy间Smad7蛋白表达量随剂量升高而增加,15Gy时下降。照射后2～9hSmad7蛋白表达量最高(P<0.05),而后降低,15h降至接近正常水平。结论以腺病毒为载体,经射线诱导Egr1基因启动子能够调控Smad7基因体内表达,Smad7基因表达量与放射剂量及放射后间隔时间有关。
- 王丽蔡旭伟冯炎傅小龙
- 关键词：介导作用SMAD7基因基因表达放射学
- 构建Egr-1启动子调控Smad7基因的重组腺病毒及启动子活性研究被引量：3
- 2005年
- 目的 构建含Egr 1启动子和Smad7cDNA的重组复制缺陷型腺病毒并研究射线诱导Egr 1基因启动子调控Smad7体外表达的时间和剂量效应 ,为下一步的基因治疗奠定基础。方法以Adeno XTM表达试剂盒为基础 ,应用分子克隆技术 ,将穿梭质粒pShuttle的CMV启动子替换为Egr 1启动子 ,将Smad7cDNA亚克隆至穿梭质粒内 ,与腺病毒DNA重组 ,在HEK2 93细胞中进行包装、扩增 ,纯化测定病毒滴度。通过Westernblot检测X射线照射激活Egr 1启动子调控Smad7体外表达的时间和剂量效应。结果 经酶切、PCR及测序鉴定证实成功构建了含Egr 1启动子和Smad7的重组复制缺陷型腺病毒pAdES。病毒滴度为 3 0× 10 1 1 TCID50 ml。感染重组腺病毒的靶细胞经不同剂量的深部X射线照射后Smad7蛋白表达量存在一定的时间、剂量差异 :实验组Smad7蛋白表达量在照射后 1h即已升高 ,2～ 7h之间维持在一个较高水平 ,尔后表达量开始下降 ;实验组中Smad7蛋白表达量随着吸收剂量的增加而增加 ,在 8～ 15Gy之间维持一个较高的表达水平。而对照组Smad7蛋白表达量无明显的时间和剂量效应。结论 成功构建了含Egr 1启动子和Smad7的重组复制缺陷型腺病毒pAdES ,重组于腺病毒内的Egr 1启动子经射线激活后具有调控下游Smad7表达的活性。
- 蔡旭伟杨健宋后燕付小龙
- 关键词：EGR-1启动子重组腺病毒X射线照射
- 外源性Smad7基因小鼠肺内定向表达的研究被引量：1
- 2006年
- 目的探讨放射线诱导Egr-1基因启动子调控腺病毒介导的Smad7基因在小鼠肺内表达的规律性、其表达的细胞内定位及小鼠耐受性。方法将Egr-1基因启动子的放射敏感元件和Smad7 cDNA包装到复制缺陷型腺病毒内,制备成AD．Egr-Smad7。120只C57BL／6J小鼠随机分组进入实验,每组6只。小鼠气管内给药,24 h后单次全胸放射。(1)66只分为11组:生理盐水组、AD．Egr-Smad7及未包装Egr-Smad7腺病毒(各分5个不同病毒滴度)组,观察给药后呼吸困难、紫绀情况及72 h内死亡情况,研究重组腺病毒滴度与小鼠急性耐受性关系。(2)36只分为6组:空白对照(C)组、单纯放射(R)组、AD．Egr-Smad7未放射(RA)组、AD．Egr-Smad7放射(RAR)组、未包装Egr-Smad7病毒未放射(AV)组及未包装Egr-Smad7病毒放射(AVR)组,放射8 Gy,5 h后免疫组织化学法检测外源性Smad7基因肺内表达的细胞内定位。(3)168只分为28组:C组、R组、RA组、BAR组、AV组及AVR组(各组按照腺病毒滴度又分为1×108、5×108、1×109 pfu／0．1 ml组,按照放射后时间又分为6 h及9 h组),放射8 Gy,研究重组腺病毒滴度与外源性Smad7基因肺内表达的关系。(4)324只分为54组:C组、R组、RA组、RAR组、AV组及AVR组(各组按照射后时间又分为放射后0、1、2、3、5、7、9、12及15 h组),放射8 Gy,研究照射后不同时间Smad7基因肺内表达的时效关系。(5)126只分为21组:C组、R组、RA组、RAR组、AV组及AVR组(各放射组按放射剂量又分为5、8、10、12、15及20 Gy组),照射后5 h研究Smad7基因肺内表达与放射剂量的关系。采用Western印迹法检测小鼠肺组织Smad7蛋白表达。结果重组腺病毒滴度在109pfu及以下时,小鼠可安全耐受,各组6只均存活,而5×109pfu及以上组小鼠5只以上死亡。AVR组外源性Smad7基因在肺泡上皮细胞、血管内皮细胞及细支气管上皮细胞胞浆内均有明显表达,而各对照组未见表达。外源性Smad7基因表达随重组�
- 王丽冯炎傅小龙蔡旭伟
- 关键词：肺纤维化基因疗法
- 含Egr-1启动子和Smad7基因的重组腺病毒的构建被引量：1
- 2004年
- 目的 :构建含Egr 1启动子和Smad7cDNA的重组复制缺陷型腺病毒并初步验证其活性 ,为下一步的基因治疗奠定基础。方法 :以Adeno XTM表达试剂盒为基础 ,应用分子克隆技术 ,将穿梭质粒pShuttle的CMV启动子替换为Egr 1启动子 ,再将Smad7cDNA亚克隆至穿梭质粒内 ,然后与腺病毒DNA重组 ,转化大肠杆菌E .coliDH5α ,PCR鉴定正确即为pAdES。脂质体法转染HEK2 93细胞 ,包装出完整腺病毒 ,然后大量扩增测定滴度。重组腺病毒感染成纤维细胞 (3T6 ) ,经深部X线照射后通过免疫细胞化学方法检测Smad7蛋白在细胞内的表达定位。结果 :经酶切、PCR及测序鉴定证实成功构建了含Egr 1启动子和Smad7的重组复制缺陷型腺病毒pAdES。病毒滴度为 1.0× 10 11TCID50 /ml。细胞免疫化学结果显示Smad7蛋白表达定位于细胞质内。结论 :利用Adeno XTM 表达试剂盒 ,通过分子克隆体外重组技术可以方便的构建重组腺病毒载体 ,并能在HEK2 93细胞内成功包装和扩增。
- 蔡旭伟杨健傅小龙
- 关键词：SMAD7基因重组腺病毒EGR-1启动子缺陷型HEK293细胞穿梭质粒
