广州市医药卫生科技项目(2007-YB-156)
- 作品数：9 被引量：16H指数：3
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- CTX-M型阴沟肠杆菌的基因克隆及原核表达产物特性研究被引量：3
- 2008年
- 目的对阴沟肠杆菌所产CTX-M型β-内酰胺酶进行基因克隆、原核表达重组质粒的构建及其特性研究。方法以产CTX-M型β-内酰胺酶的阴沟肠杆菌45号基因组DNA为模板,设计两对引物PCR扩增CTX-M,将其克隆入pGEM-T载体后测定该核苷酸序列,再将CTX-M基因克隆到pGEX-6P-3表达质粒并转入感受态BL21,选择阳性菌落进行药物敏感试验和酶动力学检测。结果PCR扩增出大小为876bp和1067bp的基因片段,与GenBank上CTX-M-9和CTX-M-3酶的基因序列同源性为100%。CTX-M-3型重组菌株药敏试验结果与原菌株相比,对青霉素类和头孢噻肟具有明显的水解作用,第三、四代头孢菌素对之较为稳定,动力学结果与酶稳定性结果基本一致。结论重组质粒pGEX-6P-3/CTX-M构建成功,CTX-M-3型重组菌株与原菌株比较,对β-内酰胺类抗生素的敏感性和稳定性增加,亲和力下降。
- 江洁华徐韫健廖伟娇李乃健
- 关键词：CTX-M型克隆重组质粒酶动力学
- 产CMY型AmpC酶费劳地枸橼酸杆菌的耐药机制研究被引量：4
- 2010年
- 目的研究产CMY型AmpC酶费劳地枸橼酸杆菌的耐药机制。方法应用VITEK-2药敏卡S检测4株费劳地枸橼酸杆菌的MIC,用PCR技术扩增ESBLs、AmpC酶基因、Ⅰ类整合子及插入序列ISEcp1B,对PCR产物进行DNA测序,并进行质粒接合试验以了解耐药基因的转移。结果 4株费劳地枸橼酸杆菌对青霉素类、头孢菌素类、喹诺酮类、氨基糖甙类抗生素均表现为耐药,但对呋喃类和碳青霉烯类表现为敏感;β-内酰胺酶基因的检出情况:TEM-1(2/4)、SHV-1(2/4)、CTX-M-G1(1/4)、DHA(2/4),Ⅰ类整合子(2/4),ISEcp1B(1/4);质粒接合试验证实其中3株费劳地枸橼酸杆菌的质粒上都含有CMY基因,为可转移质粒。结论 4株费劳地枸橼酸杆菌的β-内酰胺酶耐药基因、插入序列、Ⅰ类整合子和可转移质粒检出率较高,对费劳地枸橼酸杆菌多重耐药的形成起了重要作用。
- 张晓坤徐韫健廖伟娇江洁华李翊泉黎文成李勰璘
- 关键词：头孢菌素酶抗药性弗劳地枸橼酸杆菌
- 产CMY型AmpC酶费劳地枸橼酸杆菌的分子学特性研究被引量：1
- 2011年
- 目的对产CMY型AmpC酶费劳地枸橼酸杆菌进行耐药表型及分子学特性进行研究,探讨研制新的酶抑制剂。方法对临床分离的两株费劳地枸橼酸杆菌所产CMY型AmpC酶用纸片扩散法、三相水解试验进行耐药表型检测,以该菌总基因组DNA和质粒DNA为模板进行PCR扩增、序列分析、质粒接合试验、构建重组表达载体及AmpC酶检测。结果两株菌株对青霉素类、头孢菌素类、喹诺酮类、氨基糖苷类抗生素均表现为耐药,对呋喃类和碳青霉烯类表现为敏感;三相水解试验结果显示该菌能水解头孢西丁;PCR扩增出大小为1 146 bp的基因片段,与GenBank上多种CMY亚型的基因序列同源性为97%;质粒接合试验证实质粒上含CMY基因,为可转移质粒。结论两株菌株所产CMY型AmpC酶为新的CMY型头孢菌素酶,它介导了该菌对青霉素类、头孢菌素类、喹诺酮类等抗生素耐药,其耐药性能水平传播。
- 张晓坤徐韫健廖伟娇张东梅张丽梅
- 关键词：Β内酰胺酶类
- CMY型AmpC酶新基因亚型的序列分析与表达载体构建被引量：3
- 2009年
- 目的对两株弗劳地枸橼酸杆菌所产CMY型AmpC酶进行基因克隆、序列分析和重组表达载体的构建。方法以产CMY型AmpC酶的弗劳地枸橼酸杆菌30、31号总基因组DNA为模板，PCR扩增CMY基因，将其克隆入pGEM—T载体后测定该核苷酸序列：30、31号菌与受体菌进行质粒接合实验，构建pBV220．CMY重组表达载体。对原菌株和重组菌株进行AmpC酶检测。结果PCR扩增出大小为1146bp的基因片段，与GenBank上多种CMY亚型的基因序列同源性为97％。质粒接合实验证实质粒上含CMY基因，为可转移质粒。三维实验结果显示30、31号菌和重组菌株所产的酶均能水解头孢西丁。结论30、31号菌所产的CMY型AmpC酶为CMY新基因亚型，成功构建重组表达载体pBV220-CMY，为下一步酶的表达和纯化提供了依据。
- 徐韫健廖伟娇张晓坤江洁华张东梅张丽梅
- 关键词：AMPC酶重组质粒弗劳地枸橼酸杆菌
- CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶原核表达条件的研究被引量：1
- 2010年
- 目的探讨重组质粒pET-28a(+)/CTX-M-3分别在大肠埃希菌ER2566和BL21(DE3)中进行原核表达的最佳条件。方法分别在不同的宿主菌、诱导温度、诱导时间和诱导剂浓度中诱导pET-28a(+)/CTX-M-3融合表达载体,目的产物经SDS-PAGE和BandScan凝胶分析软件分析,以获得最佳表达条件。结果表达载体的最佳诱导条件是重组质粒在BL21(DE3)中18℃诱导24h,IPTG终浓度为0.8mmol/L;表达载体在最佳条件下表达时,目的蛋白的最高表达量占菌体总蛋白的33%。结论获得pET-28a(+)/CTX-M-3在大肠埃希菌中表达CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase,ESBLs)蛋白的最佳条件,为此酶的大量纯化奠定了基础。
- 徐韫健李翊泉廖伟娇江洁华张东梅
- 关键词：原核表达
- CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶的序列分析与原核表达被引量：4
- 2007年
- 目的对肺炎克雷伯菌所产CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)进行基因克隆和重组表达,探讨其特性。方法以产CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌49号菌总基因组DNA为模板,PCR扩增CTX-M-3,将其克隆入pGEM-T载体后测定该核苷酸序列,再将CTX-M-3基因克隆到pBV220/DH5α系统进行重组,重组菌经42℃热诱导,SDS-PAGE电泳鉴定酶蛋白的表达。结果PCR扩增出大小为876bp的基因片段,与GenBank上同类酶的基因序列同源性为100%。大肠杆菌DH5α转化pBV220/CTX-M-3重组质粒后,ESBLs试验为阳性,药敏试验结果与原菌株相比耐药性下降。此基因能在大肠埃希菌中大量表达,SDS-PAGE电泳显示,蛋白分子质量大约为31KD。结论成功表达重组的CTX-M-3型酶,为进一步做酶动力学及酶的其他分子生物学特性研究奠定基础。
- 徐韫健廖伟娇江洁华
- 关键词：超广谱Β-内酰胺酶CTX-M-3克隆
- CTX—M型和CMY型耐药基因的检测与传播机制的探讨
- 2008年
- 目的筛查广州医学院第一附属医院临床分离的80株革兰氏阴性杆菌的CTX-M型或CMy型耐药基因，检测含CTX-M型或CMY型菌株的耐药情况以及初步探讨耐药传播机制中质粒介导耐药这一途径。方法对该细菌进行总DNA的提取，PCR扩增该80株细菌的DNA。结合K-B法药物敏感试验，分析菌株的耐药特征，提取基因筛选为阳性的细菌，判定其质粒是否存在耐药基因，质粒接合试验判断是否为可接合质粒。结果检出ESBLS产酶菌CTX—M型4株，占5％，AmpC产酶菌CMY型3株，占3．75％。对耐药基因的筛选为阳性的7株菌株质粒提取，有6株菌为阳性，质粒接合试验结果显示有2株菌的质粒为可接合质粒，野生菌和接合菌的质粒中均存在耐药基因。结论CTX—M和CMY菌株呈现多重性耐药性，CTX-M和CMY菌株的耐药基因大部分位于质粒上，其中2株为可接合质粒，这一初步探讨为耐药传播机制的研究打下基础。
- 李乃健杜倩怡邱双成徐韫健
- 关键词：CTX-MCMY
- CTX-M型阴沟肠杆菌插入序列的检测
- 2010年
- 目的研究插入序列ISEcp1B及超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum beta-lactamase,ESBLs)、AmpC酶基因在CTX-M型阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae,ECL)中的分布,并分析其与耐药的关系。方法用MIC法分析2株含CTX-M基因的阴沟肠杆菌的耐药性;用多重聚合酶链反应(PCR)技术扩增ESBLs、AmpC、ISEcp1B基因及I类整合子,对PCR产物进行DNA测序。结果 2株阴沟肠杆菌对青霉素类、四代头孢菌素、喹诺酮类和呋喃类抗生素耐药,对氨基糖苷类和碳青霉烯类表现为敏感。在ECL15同时检出TEM、CTX-M-G1、ACT-1、I类整合子及ISEcp1B基因;在ECL45同时检出SHV、CTX-M-G1及ISEcp1B基因。ECL45(400 bp)ISEcp1B的右端均连接一个反向重复序列,有-35及-10两个启动子,与CTX-M型ESBLs编码起始距离不相同,与ECL15序列一致,GenBank登录号:EF437434;ECL45(500 bp)无反向重复序列,只有一个-35启动子,与CTX-M型ESBLs编码起始距离不相同,与ECL15序列不相同,GenBank登录号:EF441350。结论在CTX-M型阴沟肠杆菌中检出2种新的插入序列ISEcp1B,其对CTX-M的高水平表达和传播可能起重要的调控作用。
- 廖伟娇江洁华徐韫健李翊泉张丽梅
- 关键词：阴沟肠杆菌
- CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶的原核表达及纯化被引量：3
- 2010年
- 目的对肺炎克雷伯菌所产CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase,ESBLs)进行基因重组表达及纯化。方法以产CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶肺炎克雷伯菌总基因组DNA为模板PCR扩增CTX-M-3,将其克隆入pET-28a(+)载体,重组质粒转入大肠埃希菌ER2566中表达,表达产物经过Ni-琼脂糖凝胶柱纯化,用SDS-PAGE电泳和Western-blot鉴定纯化蛋白。结果PCR扩增出大小为876bp的基因片段,与GenBank上同类酶的基因序列同源性为100%。此基因能在大肠埃希菌ER2566中大量表达,蛋白分子质量大约为32KD得到SDS-PAGE电泳和Western-blot的证实,与理论值相符。结论成功表达及纯化CTX-M-3型超广谱β-内酰胺酶,为进一步酶生物学特性及酶的抗体制备研究奠定了基础。
- 李翊泉徐韫健廖伟娇江洁华张东梅
- 关键词：超广谱Β-内酰胺酶原核表达纯化
