江苏省自然科学基金(BK2008238)
- 作品数：12 被引量：35H指数：5
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- 更昔洛韦体外抗人巨细胞病毒的实验研究被引量：7
- 2010年
- 目的:探讨更昔洛韦体外抑制人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)的作用方式。方法:根据病毒复制周期设计3种作用模式来观察更昔洛韦对HCMV的抑制作用:模式Ⅰ将病毒与细胞混合后,再加入药物;模式Ⅱ将药物与细胞混合后,再加入病毒;模式Ⅲ将药物与病毒混合后再加入细胞。通过观察细胞病变效应,用噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞存活率,以确定该药物治疗指数。结果:更昔洛韦对人胚成纤维细胞半数中毒浓度(TC50)为1 685.23 mg/L。在模式Ⅰ中,更昔洛韦对HCMV半数抑制浓度(IC50)为35.255 mg/L,治疗指数为47.8;在模式Ⅱ和Ⅲ中,更昔洛韦对HCMV无明显抑制作用。结论:更昔洛韦对HCMV感染细胞后显示出显著的抑制作用,且随药物浓度的增加其作用逐渐增强,存在明显的量效关系。同时,体外实验显示,更昔洛韦对人胚成纤维细胞感染HCMV无预防作用。
- 顾绍庆顾小海陈慧娟李继安叶亮英郑意
- 关键词：更昔洛韦人巨细胞病毒细胞病变效应噻唑蓝比色法
- 人胚肺成纤维细胞感染人巨细胞病毒不同时间病毒载量的分析被引量：1
- 2011年
- 目的:检测人巨细胞病毒(HCMV)感染人胚肺成纤维细胞(HELF)后不同时间点HCMV DNA载量,以明确HCMV感染HELF的时效性。方法:将HCMV接种HELF细胞,收集感染后3,5,8,10,15,20,30,60,120 min时间点细胞,提取病毒DNA,以即刻早期1基因(IE-1)为靶基因进行荧光定量PCR检测。结果:在HELF受到感染的每个时间点细胞里都能检测到HCMV DNA,比较HCMV DNA拷贝数的对数发现,3,5,8,10,15,20 min组间比较及其与30,60,120 min比较,差异有统计学意义(P<0.01),而30,60,120 min之间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论:HCMV感染HELF后3 min即可以进入细胞,随后病毒量随时间而递增,达到30 min后感染量基本达到平衡,随时间的递增感染量不再明显增加。
- 李继安顾绍庆叶亮英卢亚娟郑意张晓鸣朱广丽
- 关键词：人巨细胞病毒人胚肺成纤维细胞
- 低分子质量肝素联合更昔洛韦体外抗人巨细胞病毒的作用被引量：5
- 2011年
- 目的研究低分子质量肝素(LMWH)联合更昔洛韦(GCV)体外抗人巨细胞病毒(HCMV)感染的作用。方法采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定LMWH联合GCV对人胚肺成纤维细胞(HELF)的最大无毒质量浓度(TC0)。应用体外细胞培养技术建立HCMV-A;;DOI:10.3969/j.issn.169感染HELF模型。固定联合药物中LMWH的TC0(625.00 mg.L-1),设LWMH 625.00 mg.L-1、GCV 35.00mg.L-1、GCV 17.50 mg.L-1、GCV 8.75 mg.L-1、LMWH 625.00 mg.L-1+GCV 35.00 mg.L-1、LMWH 625.00 mg.L-1+GCV17.50 mg.L-1、LMWH 625.00 mg.L-1+GCV 8.75 mg.L-17个不同用药组,分别干预HCMV感染细胞模型,使用MTT法检测各组细胞存活率,观察感染细胞特征性细胞病变(CPE),同时应用荧光定量PCR法检测用药后各组HCMV的载量。结果联合药物的TC0中GCV的质量浓度为375.00 mg.L-1,LMWH的质量浓度为625.00 mg.L-1。当HCMV A;;DOI:10.3969/j.issn.169浓度为100倍半数组织培养感染量(TCI;;DOI:10.3969/j.issn.50)感染HELF时,LMWH和GCV均可提高受染细胞存活率,降低受染细胞的HCMV ;;DOI:10.3969/j.issn.NA的拷贝数;当固定LMWH的TC0,与3种不同质量浓度GCV配伍时,均在HELF上有明显的抗HCMV的生物活性,并显示配伍后的抑制作用明显大于对应质量浓度单用GCV的抑制作用(P<0.01);当联合用药中GCV剂量减半时与全量应用GCV时的抗HCMV效果相同[即GCV 35.00 mg.L-1组与联合用药LMWH 625.00 mg.L-1+GCV 17.50 mg.L-1组的病毒抑制率和;;DOI:10.3969/j.issn.NA拷贝数比较差异无统计学意义(P>0.05)];且联合用药对细胞的毒性试验结果及显微镜下观察细胞形态变化显示,随着联合用药中二者药物质量浓度的下降,细胞存活率升高,对细胞的毒性作用减弱。结论 LMWH联合GCV具有良好的体外抗HCMV作用,二者具有协同抗病毒作用。
- 叶亮英顾绍庆郑意李继安朱广丽顾小海
- 关键词：人巨细胞病毒低分子质量肝素更昔洛韦细胞病变效应
- 人巨细胞病毒对自然杀伤细胞表面自然杀伤细胞2族成员受体表达的影响被引量：1
- 2014年
- 目的 观察人CMV对NK细胞表面自然杀伤细胞2族（NKG2）成员,包括NKG2A、NKG2C和NKG2D表达的影响.方法 免疫磁珠法提取健康人PBMC中的NK细胞,与感染人CMV的人胚肺成纤维细胞（HELF）共培养24 h;同时设未感染CMV的HELF与NK细胞共培养组和NK细胞组.流式细胞技术检测各组NK细胞NKG2A、NKG2C和NKG2D的表达.组间比较采用Wilcoxon检验.结果 感染CMV的HELF＋ NK细胞共培养组NKG2C和NKG2D表达水平为34.26％±7.99％和24.94％±5.24％,高于HELF＋NK细胞共培养组的26.31％±6.41％（Z=-3.285,P=0.001）和20.02％±6.80％（Z=-3.285,P=0.001）,也高于NK细胞组的25.78％±6.62％（Z=-3.211,P=0.001）和20.12％±6.75％（Z=-3.285,P=0.001）;而HELF＋NK细胞共培养组与NK细胞组比较差异无统计学意义（均P＞0.05）.NKG2A在各组间表达差异亦无统计学意义（均P＞0.05）.感染CMV的HELF＋NK细胞共培养组NKG2A＋ NKG2C-为2.99％±2.62％,NKG2A＋NKG2D-为6.13％±2.44％,NKG2C＋ NKG2A-为26.62％±7.63％,NKG2D＋ NKG2A为20.44％±5.68％,而HELF＋ NK细胞组分别为4.44％±4.25％（Z=-2.240,P=0.025）、6.99％±2.33％（Z=-2.053,P=0.040）、19.52％±6.80％（Z=-2.800,P=0.005）和15.78％±7.48％（Z=-2.875,P=0.004）.NKG2A＋ NKG2C＋和NKG2A＋ NKG2D＋在各组间比较差异均无统计学意义（均P＞0.05）.结论 人CMV感染可改变NK细胞受体的表达量,使NKG2C、NKG2D转导的活化性信号增强,NKG2A转导的抑制性信号减弱.
- 顾绍庆 李文静 韦苇 马晓蒙 Rupa Rana Shahi 赵媛
- 人巨细胞病毒感染对人胚肺成纤维细胞自噬的影响被引量：3
- 2017年
- 目的:研究人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染对人胚肺成纤维(MRC-5)细胞自噬的影响。方法:用HCMV AD169株(MOI=1)感染MRC-5细胞,同时将未感染HCMV的MRC-5细胞设为空白对照组。分别在感染12、24、36、48和60 h后用蛋白质印迹法检测自噬相关蛋白Beclin1和LC3蛋白以及m TOR信号通路下游磷酸化关键分子4E-BP-1-P和p70S6K-P的表达;应用荧光定量PCR检测HCMV DNA拷贝数;流式细胞仪定量检测吖啶橙荧光颗粒阳性细胞率。结果:在MRC-5细胞病毒感染组中,LC3和Beclin1蛋白表达水平均先升高再下降,与流式细胞仪检测结果一致;同时,4E-BP-1-P、p70S6K-P蛋白的表达水平先降低后升高;HCMV DNA拷贝数也是先增加后降低。而对照组中无相应分子变化。结论:HCMV感染MRC-5细胞后,在病毒增殖复制的早期(12~24 h内)可促进细胞发生自噬,晚期(24~60 h)则自噬受到抑制。其机制可能与m TOR信号通路有关,且自噬在一定程度上有利于促进HCMV在细胞中的复制增殖。
- 王雪梦吴雷顾绍庆
- 关键词：自噬人巨细胞病毒人胚肺成纤维细胞BECLIN1LC3
- 低分子肝素体外抗人巨细胞病毒的作用被引量：7
- 2010年
- 目的探讨低分子肝素(LMWH)体外对人巨细胞病毒(HCMV)的抑制作用。方法根据病毒复制周期,设计3种抗病毒作用方式观察LMWH对HCMV的抑制作用。并设更昔洛韦(GCV)为阳性对照药。1.增殖抑制法:将人胚成纤维细胞(HF细胞)以病毒悬液吸附1.5 h后,弃去病毒液后加入含不同浓度LMWH。2.感染阻断法:HF细胞加不同浓度LMWH培养1.5 h,再加入100倍半数组织培养感染量(100TCID50)的病毒感染细胞后用细胞维持液培养。3.直接杀灭法:LMWH药物与病毒共同置于培养箱中1.5 h,再感染HF细胞,1.5 h后更换成细胞维持液培养。各实验组细胞置37℃、50 mL.L-1二氧化碳恒温箱内培养,逐日在显微镜下观察细胞病变结果。待病毒对照组出现明显病变时,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法测定A490值。计算细胞存活率和病毒抑制率,并使用Probit回归法计算2种药物对HCMV的半数抑制浓度(IC50)。结果 MTT法测定正常细胞对照组及病毒对照组A490值分别为0.386±0.024和0.045±0.002。在增殖抑制法中,GCV的IC50、治疗指数(TI)分别为352.6 mg.L-1和47.8。在感染阻断法和直接杀灭法中,LMWH的IC50、TI分别为2 016.9 mg.L-1、1.12和555.5 mg.L-1、4.07。结论 LMWH具有抗HCMV作用,但作用机制与GCV不同,其通过感染阻断和直接杀灭机制发挥抗HCMV的作用,具有较明显的量效关系。
- 顾小海顾绍庆陈慧娟李继安叶亮英郑意
- 关键词：低分子肝素人巨细胞病毒细胞病变效应半数抑制浓度
- TLR8在小鼠DC2.4细胞中的表达及其作用被引量：2
- 2011年
- 目的探讨应用CL075和Poly(dT)后,TLR8及其相关细胞因子IL-12、IL-10在小鼠DC2.4细胞中的表达情况。方法常规培养DC2.4细胞,光学显微镜观察未刺激组、Poly(dT)刺激组、CL075和Poly(dT)共同刺激组细胞的形态变化;Real-timePCR测定TLR8、IL-12、IL-10的mRNA表达;ELISA测定IL-12、IL-10的蛋白表达;Western blot测定TLR8的蛋白表达。结果未刺激及Poly(dT)刺激组细胞较幼稚,树突较短且少。CL075和Poly(dT)刺激组细胞活化,树突增多且伸长;Poly(dT)刺激组DC2.4细胞中TLR8、IL-12、IL-10的mRNA及蛋白表达量与阴性对照组相比均无统计学意义。CL075和Poly(dT)刺激组DC2.4细胞中TLR8、IL-12的mRNA及蛋白表达量较阴性对照组明显升高(P<0.05或P<0.01),而IL-10的mRNA及蛋白表达量则明显低于阴性对照组(P<0.01或P<0.05)。结论应用CL075和Poly(dT)后,TLR8、IL-12在小鼠DC2.4细胞中的表达水平明显升高,而IL-10的表达水平则明显降低。
- 朱广丽顾绍庆张芸王胜军许化溪邵启祥
- 妊娠期低分子质量肝素干预对新生鼠肝细胞先天性感染人巨细胞病毒的影响被引量：5
- 2011年
- 目的探讨妊娠期应用低分子质量肝素(LMWH)对新生鼠肝细胞先天性感染人巨细胞病毒(HCMV)的病理改变和病毒;;DOI:10.3969/j.issn.NA载量的影响。方法取健康纯系清洁级Balb/c小鼠48只。随机选择配对,每对雌雄小鼠各1只。实验组20对,正常对照组4对。实验组每4对为1组,共5组,每只分别腹腔内注射6.0 log半数组织培养感染剂量(TCI;;DOI:10.3969/j.issn.50)HCMV-A;;DOI:10.3969/j.issn.169。正常对照组4对,每只腹腔内注射相应细胞维持液高糖改良Eagles培养液(;;DOI:10.3969/j.issn.MEM)1.0 mL。所有小鼠于接种后配对,隔离喂养,并观察受精情况,记录受精时间。发现妊娠后,分别予实验Ⅰ组皮下注射LMWH1 000 U.kg-1,实验Ⅱ组皮下注射LMWH500 U.kg-1,实验Ⅲ组皮下注射LMWH250 U.kg-1,实验Ⅳ组肌肉注射更昔洛韦(GCV)60 mg.kg-1,各10 d;实验Ⅴ组为阳性对照组,孕鼠不注射LMWH和GCV。每组随机取10只新生鼠,出生1 d处死,取出肝脏,进行病理学检查和荧光定量PCR检测。结果实验Ⅰ组肝组织病理损害较阳性对照组明显减轻,HCMV;;DOI:10.3969/j.issn.NA载量[(1.60±1.12)×103拷贝数/50 mg]较阳性对照组[(5.91±2.91)×107拷贝数/50 mg]显著降低(P<0.01),与实验Ⅳ组[(1.75±1.05)×103拷贝数/50 mg]比较差异无统计学意义(P>0.05)。实验Ⅱ组肝组织炎性反应较阳性对照组稍减轻。实验Ⅲ组肝组织炎性反应与阳性对照组比较无明显变化,实验Ⅲ组HCMV ;;DOI:10.3969/j.issn.NA载量为(5.49±2.76)×107拷贝数/50 mg,与阳性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论在妊娠期给予LMWH1 000 U.kg-1干预能显著降低HCMVA;;DOI:10.3969/j.issn.169株先天性感染Balb/c新生鼠肝细胞病毒感染和复制,减轻细胞炎性反应。
- 李继安顾绍庆叶亮英郑意顾小海张晓鸣朱广丽
- 关键词：人巨细胞病毒先天性感染新生鼠低分子肝素
- 人巨细胞病毒即刻早期基因功能研究
- 2014年
- 目的探讨人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)在体外增殖过程中即刻早期(immediately early,IE)基因的作用。方法设计并化学合成3条靶向IE基因外显子序列的siRNA,应用阳离子脂质体法将干扰序列转染入人胚肺成纤维(human embryonic lung fibroblast,HELF)细胞,用HCMV感染已转染入siRNA的细胞,同时设置正常对照组、阴性对照组、阳性对照组和转染试剂对照组。采用流式细胞术检测转染效果,荧光定量PCR和琼脂糖凝胶电泳方法检测分析导入的siRNA对IE基因和GAPDH阳性对照基因的抑制效果以及早期(E)基因和晚期(L)基因的表达情况。结果 siRNA成功导入HELF细胞内,6孔板内5μl脂质体可导入的最佳siRNA量约为100pmol,阳性对照组GAPDH表达量较其他对照组有明显的下降(P<0.05),抑制率为70.8%;干扰组中3条siRNA对IE基因的表达均有抑制作用。IE基因表达下调后,E基因和L基因的表达较对照组也有明显下降(P<0.05)。结论在体外,靶向IE基因的siRNA能有效抑制IE基因的表达从而影响E基因和L基因的表达,表明IE基因的有效表达是E基因和L基因表达的基础。
- 马晓蒙顾绍庆李文静韦苇赵媛
- 关键词：人巨细胞病毒即刻早期基因干扰RNA基因表达
- 先天性感染人巨细胞病毒小鼠肝脏损伤模型的建立被引量：6
- 2011年
- 目的:建立人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)先天性感染肝脏损伤的小鼠模型,为研究HC-MV感染性疾病及抗HCMV药物的筛选提供实验基础。方法:取健康纯系清洁级10周龄Balb/c鼠24只,雌雄各半,随机分为3组,每组4对。A、B两组为感染组,将6.0 logTCID50HCMV-AD169病毒悬液按1.0 ml/只接种至小鼠腹腔后雌雄交配。另一组为空白对照组,雌雄小鼠腹腔注射DMEM1.0 ml/只后交配。各组所生新生鼠分别于产后1和10天处死,取肝脏进行病毒分离、病理学检查和荧光定量PCR检测。结果:A、B两组新生鼠肝组织匀浆上清液中分离出HCMV;病理学证实肝组织有炎性改变,肝细胞浊肿、空泡变性,细胞内有特异性HCMV包涵体,部分肝细胞呈坏死表现;HCMV DNA载量分别为7.849 3×107拷贝数/50 mg、5.908 1×107拷贝数/50 mg,两组差异无统计学意义(P>0.05);对照组所生鼠肝组织各项检测未见变化。结论:HCMV可以通过胎盘造成新生鼠的先天性感染,导致肝脏损伤,生后1天和10天的新生鼠感染的病毒载量无明显变化。该模型的建立为人类先天性HCMV感染致肝脏损伤的病理过程以及对先天性感染的干预、诊断和抗病毒药物的筛选提供了可能。
- 郑意顾绍庆李继安叶亮英张晓鸣朱广丽
- 关键词：人巨细胞病毒先天性感染肝脏
