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次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷型EL/4细胞系的建立: 2011年; 目的:建立稳定的次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine guanine phosphoribosyltransferase,HG-PRT)缺陷型EL/4细胞系,为小鼠T细胞杂交瘤的制备奠定基础。方法:通过乙基甲磺酸(ethyl methanesulfonate,EMS)提高EL/4细胞的基础突变率,用8-氮杂鸟嘌呤(8-Azaguanine,8-AG)从5μg/ml到80μg/ml浓度逐渐筛选出对8-AG有稳定抗性的细胞株EL/4,并对其生物性状与基因表型进行鉴定。结果:通过筛选获得能够耐受高浓度(80μg/ml)8-AG的EL/4细胞,并能长期在20μg/ml 8-AG培养液中正常生长,但不能耐受次黄嘌呤-氨甲蝶呤-胸腺嘧啶(hypoxanthine-aminopterin-thymidine,HAT)培养基(3 d全部死亡),RT-PCR未能从该EL/4细胞中检测出HGPRT基因的表达,由此可见该EL/4细胞的HGPRT基因发生突变或者缺失。将该细胞经克隆后获得单克隆细胞株,并命名为突变的EL/4(mutant EL/4,mEL/4)。该细胞株能与磁珠分离的小鼠脾脏来源的CD4+T细胞在PEG作用下顺利进行融合。结论:成功建立了HGPRT缺陷型EL/4细胞系mEL/4,为制备T细胞杂交瘤奠定了基础。; 龚文禚娅蒋砚秋潘晓园邵启祥; 关键词：突变

mLumin转染人肝癌HepG2细胞系的建立被引量：1: 2011年; 目的:建立mLumin+的HepG2细胞系,为进一步建立肿瘤模型和小动物荧光成像观察奠定基础。方法:采用磷酸钙法,将pcDNA3.0-mLumin质粒转染至人肝癌细胞系HepG2,经G418筛选扩增后通过PCR检测mLumin基因在转染的肝癌细胞HepG2中的表达情况,同时应用荧光显微镜及流式细胞仪检测mLumin+的HepG2细胞比例,最终将其接种于裸鼠的皮下,观察致瘤情况。结果:RT-PCR鉴定证实肝癌细胞HepG2中有mLumin基因的mRNA表达。在倒置荧光显微镜下,采用绿光(540 nm)激发时,可以见到大量的发射红色荧光的细胞,流式细胞术检测有50%的阳性率。小动物活体成像仪显示裸鼠皮下接种能够成瘤,组织冰冻切片也证实HepG2细胞中有大量mLumin蛋白表达。结论:成功建立了mLumin+的HepG2细胞,为进一步进行肿瘤的基础和应用研究奠定了基础。; 刘霞闫美娜王荟万洋洋许凤姣邵青成静范兴文石慧娜邵启祥; 关键词：HEPG2 活体成像

hFOXP3-Δ E251的克隆及在大肠杆菌中的表达: 2010年; 目的:构建和表达带HIV-TAT穿膜序列(Protein transduction domain,PTD)的人FOXP3突变体PTD-hFOXP3-Δ E251,为研究人FOXP3的功能奠定基础。方法:采用逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法,从人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)总RNA中扩增得到人FOXP3(hFOXP3)的cDNA,然后再利用重叠PCR技术扩增获得hFOXP3-ΔE251基因实变体片段。将该重组突变体插入表达载体pET28a-PTD中,构建表达质粒pET28a-PTD-hFOXP3-ΔE251,然后转化感受态细菌E.coli Rosetta(DE3),最终采用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β -D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导表达。结果:SDS-PAGE电泳分析发现,经0.5mM IPTG诱导8h后,可高效表达重组的融合蛋白,表达产物以包涵体形式存在。结论:成功制备了带穿膜序列的人FOXP3ΔE251突变体融合蛋白,为更好地研究人FOXP3的功能与特性奠定了实验基础。; 蔺昕许逊宗扬勇邵启祥; 关键词：基因克隆大肠杆菌

PTD-mLumin-HMGB1 A原核蛋白的表达、纯化及初步鉴定: 2012年; 目的:构建含有蛋白转导结构域(protein transduction domain,PTD)和荧光蛋白mLumin的人HMGB1 A盒原核表达载体,表达并纯化PTD-mLumin-HMGB1 A融合蛋白。方法:利用基因重组技术构建pET28a-PTD-mLumin-HMGB1 A融合蛋白原核表达载体,并在大肠埃希菌Rosette(DE3)中表达融合蛋白,经Ni2+分离柱纯化PTD-mLumin-HMGB1 A融合蛋白,激光共聚焦显微镜观察其穿膜能力。结果:成功构建了PTD-mLumin-HMGB1 A原核表达载体,并表达和纯化了PTD-mLumin-HMGB1 A融合蛋白,该融合蛋白能高效地穿过细胞膜进入细胞内。结论:成功地表达和纯化了PTD-mLumin-HMGB1 A融合蛋白,此融合蛋白具有良好的穿膜能力,为更好地研究HMGB1 A的细胞内定位和体内定位提供了重要的依据。; 高升刘月芳田伊卿吉滢曾子涵殷丝雨邵启祥; 关键词：蛋白转导结构域高迁移率族蛋白1 融合蛋白

抗原特异性T细胞活化后Foxp3、CTLA-4及细胞因子mRNA表达水平的动态分析: 2010年; 目的研究抗原特异性T细胞活化后,其所表达的Foxp3、CTLA-4和细胞因子的动态变化,为深入了解特异性免疫应答调控奠定基础。方法体外采用树突状细胞(DC)系D2SC/1作为抗原提呈细胞(APC)将OVA323-339直接提呈给OVA特异性TCR转基因小鼠DO11.10来源的CD4^+T细胞。采用CCK-8法测定细胞活化增殖情况,并应用Real time-PCR动态分析细胞因子IL-2、IFN-γ、IL-10、TGF-β,CTLA-4和Foxp3的mRNA表达水平。结果OVA特异性T细胞活化所需的最佳OVA剂量为2μmol/L,T细胞活化后IL-2、IFN-γ、IL-10和TGF-βmRNA表达水平最高峰值分别在8、4、2 h和8 h,Foxp3 mRNA在2 h时有一过性的表达峰,随后在24 h又有所升高,而CTLA-4 mRNA在静止时有较高水平的表达,但活化后迅速下调,其在24 h内无明显变化。结论初步了解了适应性免疫应答中Foxp3、CTLA-4和主要免疫调节相关的细胞因子表达趋势,为深入研究适应性免疫应答调控机制奠定初步基础。; 季宝菊刘静招倩倩黄莺周小兵史利云邵启祥; 关键词：抗原特异性 CD4+T

基于口服免疫耐受原理的人肿瘤小鼠荷瘤模型的建立被引量：2: 2013年; 目的:基于口服免疫耐受原理,建立针对人特异性免疫耐受的人类肿瘤小鼠荷瘤模型。方法:将90只昆明种小鼠随机分为肿瘤模型组、无关肿瘤对照组和空白对照组,每组30只。分别以人肝癌HepG2细胞系、人卵巢癌3AO细胞系和等体积生理盐水连续灌胃7 d,然后于背部皮下注射人肝癌HepG2细胞系。观察肿瘤形成情况,测量不同时间段肿瘤组织的大小,并对肿瘤组织作病理切片于光学显微镜下观察。结果:人肝癌HepG2细胞系能在HepG2细胞灌胃小鼠的皮下成活并形成肿瘤,致瘤率可达90%(27/30);而生理盐水对照组和无关肿瘤对照组的小鼠均未成瘤。局部组织经病理切片,HE染色,在肿瘤模型组可见肿瘤组织,而无关肿瘤对照组和生理盐水对照组可见明显的肿瘤细胞死亡后的残留痕迹。结论:通过口服肿瘤细胞产生特异性免疫耐受,成功地建立了相应的人肿瘤小鼠模型。; 刘霞成静范兴文周小兵周丹吴卫疆华晔邵启祥; 关键词：口服免疫耐受小鼠肿瘤模型

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江苏省自然科学基金(BK2008231)