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可磷酸化短肽偶联壳聚糖介导IGF-1和IL-1RA双基因联合治疗兔关节软骨损伤被引量：2: 2015年; 非病毒基因转移载体壳聚糖被广泛用于基因转染,然而,相对较低的转染效率限制了其在基因治疗中的应用.本课题组曾经报告可磷酸化短肽修饰壳聚糖(phosphorylatable short peptide coupled chitosan,pSP-CS)可增加体外培养细胞的DNA转染效率.本研究采用pSP-CS作为基因载体,介导人白细胞介素-1受体拮抗剂基因(interleukin-1 receptor antagonist gene,IL-1RA)和人胰岛素样生长因子-1基因(insulin-like growth factor 1 gene,IGF-1)局部转染,联合治疗兔关节软骨损伤.将pSP-CS与单基因表达质粒p Bud CE4.1-IGF-1、p Bud CE4.1-IL-1RA和共表达质粒p Bud CE4.1-IGF-1+IL-1RA制成pSP-CS/p DNA复合物,制备股骨外侧髁全层软骨损伤模型,pSP-CS/p DNA复合物关节腔内注射4周.ELISA分析发现,转基因组关节腔灌洗液中含有大量外源蛋白IGF-1和IL-1RA.定量PCR检测mRNA显示,各转基因组明显下调基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3,Mmp-3)基因表达;上调基质金属蛋白酶抑制剂-1(matrix metalloproteinase inhibitor-1,Timp-1)和二型胶原(Collagen II)基因表达(P<0.05);双基因转染组作用明显优于单基因转染组(P<0.05).HE及Collagen II免疫组化染色显示,各转基因组软骨损伤处出现不同程度的软骨性修复,以双基因转染组作用最优.本研究表明,pSP-CS可以携带外源基因进入软骨组织并局部大量表达,IGF-1与IL-1RA协同作用明显促进损伤软骨修复,为今后临床多基因治疗软骨损伤提供了实验基础.; 赵荣兰彭效祥宋伟李倩; 关键词：软骨损伤白细胞介素1 胰岛素样生长因子1

可磷酸化短肽偶联壳聚糖介导兔关节软骨损伤修复的基因治疗被引量：7: 2014年; 目的探讨可磷酸化短肽（phosphorylatable short peptide,pSP）偶联壳聚糖（chitosan,CS）（pSP-CS）,携载IGF-1和IL-1受体拮抗剂（IL-1 receptor antagonist,IL-1Ra）基因,局部转染促进关节软骨损伤修复的作用。方法构建pBudCE4.1-IL-1Ra、pBudCE4.1-IGF-1及pBudCE4.1-IL-1Ra＋IGF-1质粒,以pSP偶联CS形成pSP-CS,将以上重组质粒分别与其复合形成pSP-CS/质粒DNA（pDNA）复合物。取3月龄健康雄性新西兰大耳白兔30只,体重2.0-2.5 kg,双侧后肢随机分为5组（n=12）。假手术组（A组）仅暴露股骨外侧髁关节面,pSP-CS/pBudCE4.1干预组（B组）、pSP-CS/pBudCE4.1-IL-1Ra干预组（C组）、pSP-CS/pBudCE4.1-IGF-1干预组（D组）、pSP-CS/pBudCE4.1-IL-1Ra＋IGF-1干预组（E组）制备膝关节外侧髁软骨缺损模型。术后1周,各干预组给予对应pSP-CS/pDNA复合物,共7周;A组注射等量生理盐水。术后观察动物一般情况,8周时处死实验动物,取关节腔灌洗液ELISA分析IL-1Ra及IGF-1含量;实时荧光定量PCR检测缺损区软骨组织聚集蛋白聚糖（Aggrecan）、基质金属蛋白酶3（matrix metalloproteinase 3,MMP-3）、MMP抑制剂1（MMP inhibitor 1,TIMP-1）mRNA表达;阿尔辛蓝-过碘酸雪夫（alcian blue-periodic acid/schiff,ABPAS）染色及Aggrecan免疫组织化学染色鉴定损伤区新生细胞的软骨细胞表型,分析Aggrecan染色吸光度（A）值。结果实验动物术后无感染及死亡。各干预组关节腔灌洗液中检测到大量外源蛋白IGF-1和IL-1Ra,其中D、E组IGF-1含量以及C、E组IL-1Ra含量显著高于A组（P〈0.05）。E组Aggrecan和TIMP-1 mRNA表达上调,MMP-3 mRNA表达下调,明显优于C、D组（P〈0.05）。C、D、E组缺损处出现不同程度软骨性修复,AB-PAS染色及Aggrecan免疫组织化学染色均为阳性,且E组作用明显优于C、D组（P〈0.05）;B组缺损处仅被大量纤维组织增生和炎性细胞浸润,未见明显软骨性修复。结论 pSP-CS是一种较理想的基因载体,可携载治; 赵荣兰彭效祥楚海荣宋伟刘庆; 关键词：软骨损伤基因治疗 IL-1受体拮抗剂

双功能短肽修饰壳聚糖介导miR-140基因修复兔关节软骨损伤的效果: 2018年; 目的观察核定位信号肽偶联核激酶底物短肽（NNS）修饰的壳聚糖（CS）（NNSCS）介导人miR-140基因，局部转染促进兔关节软骨损伤修复的效果。方法构建GV268-miR-140真核表达质粒，将NNSCS分别与阴性对照质粒GV268及重组质粒GV268-miR-140复合形成NNSCS／GV268及NNSCS／GV268-miR-140复合物。选取健康雄性新西兰大耳白兔18只，单侧右后肢按随机数字表法分成转基因组（A组）、阴性对照组（B组）、假手术组（C组），每组6只。A组与B组均制备股骨滑车全层软骨损伤模型；C组仅暴露股骨滑车关节面。术后1周，A组给予NNSCS／GV268-miR-140复合物，B组给予NNSCS／GV268复合物，C组给予等量等渗盐水，每周2次，持续7周。术后8周末，处死动物并取材。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测缺损区软骨组织内miR-140、Sox9、Aggrecan和Hdac4表达；HE染色、番红O-固绿染色及Aggrecan免疫组化染色评估缺损区软骨修复情况。结果RT-qPCR检测结果显示，A组miR-140表达水平（3．16±0．37）较B组（1．00±0．24）和C组（1．24±0．18）明显升高（P〈0．05）；A组Sox9表达水平（4．38±0．66）较B组（1．04±0．04）和C组（1．19±0．30）明显上调（P〈0．05）；A组Aggrecan表达水平（3．63±0．58）较B组（1．21±0．14）和C组（1．34±0．13）明显上调（P〈0．05）。A组Hdac4表达水平（0．37±0．06）较B组（0．81±0．06）明显下调（P〈0．05）。HE染色、番红O-固绿染色及Aggrecan免疫组化染色显示，A组缺损处呈现明显的软骨性修复，B组缺损处出现大量纤维组织增生和炎性细胞浸润，未见软骨性修复。结论NNS可携带外源基因进入软骨细胞并在局部大量表达；高表达的miR-140可能通过上调Aggreean和Sox9表达及下调Hdae4表达，从而明显促进损伤软骨的修复，可为其今后用于治疗软骨损伤提供实验基础。; 彭效祥张洋洋宋伟孙艳丽王鲁娟刘庆赵荣兰; 关键词：微RNAS 软骨关节信号肽

可磷酸化短肽偶联壳聚糖介导IL-1RA与IGF-1共转染对兔关节软骨细胞的作用被引量：3: 2014年; 探讨可磷酸化短肽偶联壳聚糖(phosphorylatable short peptide coupled chitosan,pSP-CS),介导人白细胞介素-1受体拮抗剂基因(interleukin-1 receptor antagonist protein,IL-1RA)和人胰岛素样生长因子1基因(insulin-like growth factor-1,IGF-1)共转染,对体外培养的兔关节软骨细胞的作用.将pSP-CS与共表达质粒p Bud CE4.1-IL-1RA+IGF-1、单基因表达质粒p Bud CE4.1-IL-1RA、p Bud CE4.1-IGF-1和空质粒p Bud CE4.1制成pSP-CS/p DNA复合物,转染体外分离培养的正常兔原代关节软骨细胞.ELISA法检测IL-1RA和IGF-1的表达,以表征pSP-CS转染效率;Cell Counting Kit-8(CCK-8)法分析软骨细胞的增殖活力;流式细胞仪检测软骨细胞的凋亡;定量PCR检测软骨细胞中基质金属蛋白酶抑制剂-1(matrix metallo-proteinase inhibitor-1,Timp-1)、基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinase-3,Mmp-3)、聚集蛋白聚糖(Aggrecan)基因表达.转基因组IL-1RA和IGF-1有较高的表达水平;各转基因组明显促进细胞增殖、抑制细胞凋亡、下调Mmp-3基因表达、上调Timp-1和Aggrecan基因表达,且双基因组作用明显优于单基因组(P<0.05).结果表明,pSP-CS可以携带外源基因进入软骨细胞并大量表达,IGF-1与IL-1RA协同作用明显提高体外培养软骨细胞的生物活性,为今后研究pSP-CS介导多基因体内治疗软骨损伤提供了基础.; 赵荣兰彭效祥; 关键词：磷酸化软骨细胞胰岛素样生长因子1 白细胞介素1

IGF—I对破骨细胞骨吸收的促进作用依赖于成骨细胞的协同被引量：4: 2012年; 目的探讨胰岛素样生长因子I（IGF-I）对破骨细胞骨吸收的促进作用是否需要成骨细胞的协同。方法体外培养MC3T3小鼠成骨细胞及NF—KB受体的配体（receptor activator o fNF—KBligand，RANKL）诱导分化成熟的破骨细胞，分别给予重组人胰岛素样生长因子I（rhIGF—I）进行干预，Western印迹检测IGF—I受体的活化情况。以0、10ng／ml的rhIGF—I直接干预破骨细胞或与成骨细胞在Transwell双层培养板中共培养的破骨细胞，MTT法测定破骨细胞增殖；流式细胞仪检测破骨细胞凋亡率：实时PCR检测组织蛋白酶K基因的表达。将不同方式干预的破骨细胞接种在骨磨片上，光镜观察骨吸收陷窝的形成。结果在成骨细胞、破骨细胞表面均检测到可被IGF—I激活的IGF—I受体。仅在成骨细胞、破骨细胞共培养时rhIGF—I能够促进破骨细胞活细胞的增殖（P〈0．05）；抑制破骨细胞的凋亡（P〈0．05）；上调组织蛋白酶K基因的表达（P〈0．05）；增加骨吸收陷窝的数量及面积。IGF—I对单独培养的破骨细胞则作用不明显。结论IGF—I对破骨细胞骨吸收的促进作用需要成骨细胞的协同。; 赵荣兰彭效祥楚海荣宋伟李广宙梁东春; 关键词：胰岛素样生长因子I 破骨细胞成骨细胞 RANKL

组织工程化软骨修复关节软骨损伤研究进展被引量：2: 2017年; 关节软骨自身修复能力差,其损伤后的有效治疗成为临床难题。软骨组织工程中种子细胞、支架及生物活性因子是目前研究的热点。体内软骨生长的微环境中含有多种生物活性因子,各因子间相互影响构成纵横交错的关系网。然而,外源性因子半衰期短,易降解,很难达到修复损伤软骨需要的浓度。转基因技术在组织工程中的应用实现了外源性生物活性因子在局部持续并高效的表达,促进了损伤软骨修复。该文就组织工程化软骨修复关节软骨损伤研究进展作一综述。; 张洋洋彭效祥赵荣兰; 关键词：关节软骨

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山东省自然科学基金(ZR2012HQ034)

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