国家自然科学基金(30872564)
- 作品数：5 被引量：5H指数：1
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- 相关机构：华中科技大学武汉市中心医院更多>>
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- 产甲酸草酸杆菌FRC基因慢病毒表达载体构建及鉴定被引量：1
- 2011年
- 产甲酸草酸杆菌（Oxalobacter{ormigenes，m．F）是一种寄居于脊椎动物胃肠道、依赖分解肠道草酸生存的革兰阴性菌。我们采用基因克隆重组技术从前期分离培养的中国人肠道Ox．F[3-中克隆了草酸分解关键酶——甲酰辅酶A转移酶（FCoAT）基因FRC，并成功构建重组慢病毒表达载体pLenti6．3FRC—IRES-EGFP，为高草酸尿症基因治疗提供基础。
- 杨欢 陈志强 叶章群 王博涵 Yussupbayeva Aliya 姚炜敏 夏丁 余虓 刘冠琳 孔德波 姚林方
- 关键词：慢病毒表达载体表达载体构建C基因基因克隆
- 稳定表达绿色荧光的大鼠胚胎来源肝干细胞被引量：1
- 2010年
- 背景:胎肝来源肝干细胞作为细胞移植的供体来源具有优势,但有鉴于干细胞特质,其培养困难,传代后易分化生长;且现有干细胞示踪定位技术欠成熟,这些均是制约肝干细胞移植的重要因素。目的:观察原代肝干细胞电转pEGFP-Cl质粒是否能获得稳定表达绿色荧光的肝干细胞。方法:联合机械分离和胶原酶消化法体外分离孕13.5dSD大鼠胚胎来源肝细胞,应用特异培养基培养分离细胞,随后通过半量换液法纯化出肝干细胞,采用细胞免疫荧光法对贴壁细胞进行鉴定,并用pEGFP-Cl质粒电转染原代肝干细胞后持续表达绿色荧光作示踪定位标志。结果与结论:原代培养的胎肝干细胞24h后可见细胞半贴壁,形态基本相同,呈圆形或卵圆形;第2天观察细胞为大小几乎一致的圆形;培养第3天出现一些由3,5个形态一致的细胞集落,细胞直径6～10μm;细胞集落不断增大,至第5天集落中细胞数量增至10个左右,集落由大小不等的致密圆形细胞组成,界限清楚;第8天后细胞呈上皮样铺展;第12天时,细胞变大呈煎蛋样摊开,形态不规则,细胞浆内可见颗粒,生长变得缓慢;传代后细胞扩增速度无明显变化,至第3代仍保持较均一的上皮细胞状;通过细胞免疫荧光法检测出培养第5天的贴壁细胞表达干细胞标志物CD34和胆管细胞标志物CK19;经筛选pEGFP-Cl质粒电转染后的原代肝干细胞能稳定表达绿色荧光。实验成功构建转染了绿色荧光蛋白的肝干细胞。
- 杨欢叶章群陈志强王博涵姚炜敏
- 关键词：肝干细胞CD34CK19转染
- 大鼠胚胎来源肝干细胞分离纯化方法的比较被引量：1
- 2010年
- 目的 观察比较机械分离法和酶消化法分离纯化孕鼠胚胎来源肝干细胞的优劣.方法 取孕13.5 d SD大鼠胚胎肝后分别用机械分离法和酶消化法分离纯化肝干细胞,比较两种方法所得细胞总量和存活率的差异,用免疫荧光染色法鉴定细胞,并比较原代培养前后肝干细胞存活率的变化.结果两种方法分离培养出的细胞形似卵圆形,经免疫荧光染色法检测表达干细胞标志物CD34和胆管细胞标志物CK19,机械分离法分离的肝干细胞数量（57.49±14.25）×106与酶消化法（63.36±12.67）× 106相当,两者比较差异无统计学意义（P〉0.05）,但机械分离法所得肝干细胞的存活率（96.37±0.82）%高于酶消化法（93.53±0.63）%（P〈0.05）,并且培养前后细胞存活率也明显高于酶消化法,两两比较差异有统计学意义（P〈0.05）.结论 机械分离法是一种简单、经济、实用的胚胎来源肝干细胞分离纯化方法.
- 杨欢叶章群陈志强王博涵刘冠林余虓郭辉夏丁
- 关键词：肝干细胞胚胎
- 维生素D受体基因Fok Ⅰ和Taq Ⅰ位点单核苷酸多态性与特发性低枸橼酸尿症的关系被引量：2
- 2010年
- 目的探讨维生素D受体(VDR)基因FokⅠ和TaqⅠ位点单核苷酸多态性与特发性低枸橼酸尿症的关系及其临床意义。方法筛选特发性低枸橼酸尿症患者31名,50名尿枸橼酸水平正常者为对照组,通过PCR-RFLP技术检测VDR基因FokⅠ及TaqⅠ位点单核苷酸多态性,并分析其与特发性低枸橼酸尿症之间的相关性。结果特发性低枸橼酸尿症患者组与对照组之间,VDR基因FokⅠ位点及TaqⅠ位点各基因型频率差异具有统计学意义(均P<0.05),在特发性低枸橼酸尿症患者组中ff和TT型较为多见。并且,在两组人群中24 h尿枸橼酸含量,基因型为ff和TT者分别为(1.91±1.03)、(1.90±0.96)mmol/24 h,明显低于FF、Ff、Tt和tt基因型者[(2.67±1.02)、(2.55±0.95)(、2.58±0.98)(、2.72±1.05)mmol/24 h,P<0.05)。结论特发性低枸橼酸尿症与VDR-FokⅠ及VDR-TaqⅠ单核苷酸多态性间存在遗传相关性,VDR基因FokⅠ位点的ff型基因和TaqⅠ位点的TT型基因有望成为特发性低枸橼酸尿症的遗传标志基因。
- 朱晨曦叶章群陈志强
- 关键词：单核苷酸多态性
- 产甲酸草酸杆菌甲酰辅酶A转移酶基因和草酰辅酶A脱羧酶基因慢病毒表达载体的构建及鉴定
- 2012年
- 目的构建尉人肠道米源产甲酸草酸杆菌（OxCF）甲酰辅酶A转移酶（FCoAT）基因（FRC）和草酰辅酶A脱羧酶（OCoAD）基因（OXC）的重组慢病毒pLenti6．3-FRC—IRES—EGFP和pLenti6．3-OXC—IRES—DsRED，为高草酸尿症的基因治疗奠定基础。方法采用Taq高保真DNA聚合酶从OxCF基因组中扩增FRC基因和OXC基因片段，用DNA凝胶回收试剂盒切胶回收，用DNA连接试剂盒将回收产物分别与pMD18-TSimple载体连接获得FRC和OXC的克隆载体，并转化大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑取阳性克隆并测序，筛选携带完整目的基因质粒pMD18Tsimple—FRC和pMD18Tsimple—OXC，用BamHI酶切获得目的基因，连接FRC和携带绿色荧光蛋白的pLenti6．3／v5DEST—IRES—EGFP，连接OXC与表达红色荧光蛋白的pLenti6．3／v5DEST—IRES—DsRED，转化DH5a后挑取阳性克隆并测序。构建的慢病毒过表达载体pLenti6．3-FRC—IRES—EGFP和pLenti6．3-OXC—IRES—DsRED转染ttEK293T细胞，包装并测滴度。结果聚合酶链反应（PCR）从OxCF基因组中扩增分获得1．3kh和1．7kh的DNA片段，与Genbank中FRC（U82167）间碱基序列匹配率为95．88％，存在53个碱基的变异；与Genbank中OXC（M77128）间碱基序列匹配率为93．61％，存在109个碱基的变异；测序证实pLenti6．3-FRC—IRES—EGFP和pLenti6．3-OXC—IRES—DsRED分别含有大小正确的正向FRCcDNA和OXCcDNA，转染ttEK293T细胞实验24h后，在荧光显微镜下相应可见大量绿色荧光和红色荧光，两种慢病毒滴度分别为1．15×10^8TU／ml和9．75×10^7TU／ml。结论成功构建表达OxCF中草酸分解关键基闵FRC和OXC的重组慢病毒载体，并通过转染293细胞制备了高滴度慢病毒。
- 杨欢陈志强叶章群王博涵艾丽娅姚炜敏
- 关键词：慢病毒载体高草酸尿症
