国家自然科学基金(30170412)
- 作品数：6 被引量：19H指数：3
- 相关作者：李定国陈颖伟王连升陈源文胡良凯更多>>
- 相关机构：上海第二医科大学附属新华医院上海第二医科大学上海交通大学医学院附属新华医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金上海市科学技术发展基金上海市自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- RGD-M6P对原代肝星状细胞的影响被引量：2
- 2005年
- 目的探讨精氨酸 -甘氨酸 -天冬氨酸 (RGD)和甘露糖 - 6 -磷酸 (M6P)的复合体 (RGD M6P)对原代肝星状细胞 (HSC)活化及细胞外基质分泌水平的影响。方法应用胶原酶原位灌注法分离原代HSC ,接种培养 4 8h后 ,随机分成空白对照组、转化生长因子β1(TGFβ1)组、M6P组、RGD组和RGD M6P组。培养 5d后 ,应用免疫组化方法检测各组HSCα SMA表达水平变化 ,双抗体夹心ABC酶免测定法检测培养 7d细胞的上清液中Ⅲ型前胶原 (PCⅢ )含量。结果RGD M6P组原代HSC细胞上清液PCⅢ含量和α SMA表达明显低于TGFβ1组和M6P组 (P <0 .0 5 ) ,而与RGD组比较无显著差异。结论RGD M6P显著减少原代HSCα SMA的表达水平 ,明显降低培养上清中PCⅢ含量 。
- 王连升陈颖伟张建华李定国陆汉明
- 关键词：RGDHSC肝星状细胞TGFΒ1分泌水平接种培养
- 新型Smad7重组腺病毒载体的构建被引量：6
- 2004年
- 目的构建鼠Smad7重组复制缺陷型腺病毒载体(AdSmad7)。方法采用常规分子生物学方法,抽提SD大鼠肝脏总RNA,RT-PCR获得鼠Smad7 cDNA片段,插入腺病毒穿梭载体质粒pAdDTrack CMV启动子下游,构建重组穿梭载体pAdTrack-CMV-Smad7,线性化后与腺病毒骨架载体质粒AdEasy-1在细菌BJ5183内同源重组,鉴定后在HEK293细胞包装成重组腺病毒AdSmad7。RT-PCR检测AdSmad7在HEK293中的表达情况。结果该重组缺陷型腺病毒载体经测序、限制性内切酶酶切分析、PCR等鉴定,与预期结果一致;重组腺病毒质粒转染HEK293细胞后3 d可观察GFP明显表达;RT-PCR检测证实Smad7表达增强。结论利用新型腺病毒载体AdEasy系统可快速构建同时表达GFP和Smad7的重组复制缺陷型腺病毒AdSmad7,为进一步研究TGFβ信号转导和肝纤维化的基因治疗奠定基础。
- 陈颖伟胡良凯陈源文李定国
- 关键词：重组腺病毒载体信号转导TGF-Β分子生物学
- 外源Smad7基因对原代肝星状细胞活性和基因表达调控的影响被引量：6
- 2005年
- 目的研究外源Smad7基因对原代肝星状细胞(HSC)活性和基因表达调控的影响。方法采用胶原酶原位灌注、密度梯度离心法分离SD大鼠原代HSC,并予转化生长因子β1(TGFβ1)刺激,同时分别以重组腺病毒AdSmad7和对照病毒AdGFP感染原代HSC,RTPCR法检测TGFβ1、Smad3mRNA、Smad7mRNA在HSC中的表达,免疫细胞化学法检测HSC中α平滑肌肌动蛋白(αSMA)和Smad7表达。结果RTPCR显示,与TGFβ1对照组比较,AdSmad7组Smad7mRNA表达显著上调(P<0.05),但TGFβ1和Smad3mRNA表达差异无统计学意义。免疫细胞化学染色显示,与其他各组比较,AdSmad7组HSC胞质中Smad7表达最高,αSMA表达则明显降低(P<0.01)。结论重组复制缺陷型腺病毒AdSmad7可在HSC中高效表达;外源Smad7基因可阻断TGFβ1对HSC的活化作用,但对Smad3和TGFβ1mRNA表达无明显影响。
- 陈颖伟陈源文尤汉宁李定国
- 关键词：腺病毒载体SMAD7基因基因表达调控外源
- 人工合成RGD小肽对肝星状细胞分泌细胞外基质的影响被引量：2
- 2004年
- 目的 :探讨精氨酰甘氨酰天冬氨酸肽 (Arg -Gly -Asp ,RGD)对肝星状细胞分泌细胞外基质 (extra cellularmatrix ,ECM)的影响。方法 :利用化学方法合成RGD ;应用胶原酶原位灌注法分离SD大鼠原代肝星状细胞 (hepaticstallatecell,HSC) ,接种培养 4 8h后 ,随机分成 4组 :①空白对照组 ;②转化生长因子 β1(transform inggrowthfactorβ1,TGFβ1)组 :只加TGFβ1(终浓度 5ng/ml) ;③RGD组 :只加RGD(终浓度 10 0 μg/ml) ;④联合加药组 :加RGD(终浓度 10 0 μg/ml)同时加TGFβ1(终浓度 5ng/ml)。连续培养 3d后 ,放射免疫分析细胞上清液各项ECM含量变化。结果 :与空白对照组相比 ,TGF β1组和联合加药组细胞上清液中透明质酸(hyaluronicacid ,HA)、层粘连蛋白 (laminin ,LN)和Ⅲ型前胶原 (procollagenⅢ ,PCⅢ )水平均显著增高 ,RGD组细胞上清中各项ECM水平则无明显改变 ;与TGFβ1组相比 ,联合用药组HSC细胞上清LN和PCⅢ水平明显降低。结论 :RGD明显降低HSC培养上清中LN和PCⅢ含量 ,表明RGD能抑制原代HSC合成及分泌ECM ,其机制可能与竞争性结合整合素有关。
- 杜学亮陈颖伟王连升徐芹芳李定国吴真
- 关键词：RGD肝星状细胞胞外基质药组分泌细胞
- Smad7基因过表达对L02肝细胞株增殖的影响被引量：3
- 2005年
- 目的观察外源Smad7基因对L0 2肝细胞株增殖活性的影响。方法分别以重组腺病毒AdSmad7和对照病毒AdGFP在体外感染L0 2肝细胞 ,以RT PCR和Western blot检测外源Smad7基因表达情况 ,MTT法检测L0 2肝细胞增殖活性 ,流式细胞仪检测其细胞周期变化。结果AdSmad7体外感染L0 2肝细胞后 ,Smad7mRNA和蛋白水平均显著上调。转化生长因子 β(TGFβ)可抑制L0 2细胞增殖 ,诱导其凋亡。导入外源Smad7可拮抗TGFβ的作用。结论利用AdSmad7导入外源Smad7基因可间接促进肝细胞增殖 。
- 陈颖伟陈源文王连升李定国
- 关键词：SMAD7基因肝细胞增殖增殖体外感染L02细胞
- 外源Smad7基因对四氯化碳诱导大鼠实验性肝纤维化的影响
- 2010年
- 目的研究外源Smad7基因对四氯化碳(CCl4)诱导的大鼠实验性肝纤维化的影响。方法将40只雄性SD大鼠随机分为4组。第一组为正常对照组,其余3组采用CCl4皮下注射法建立大鼠肝纤维化模型,并在实验第2周和第4周分别经尾静脉导入生理盐水、重组复制缺陷型腺病毒AdSmad7或对照病毒AdGFP。标准酶法测定各组大鼠肝功能情况;放射免疫法测定血清Ⅲ型前胶原(PCⅢ)、层粘连蛋白(LN)、Ⅳ型胶原(CⅣ)水平;RT-PCR法检测大鼠肝组织Smad7 mRNA表达。免疫组织化学法测定α-肌动蛋白(α-SMA)、Smad7表达;肝组织切片采用HE和VG染色进行肝纤维化程度分级。结果与模型对照组相比,AdSmad7导入组大鼠血清谷丙转氨酶(GPT)和碱性磷酸酶(AKP)水平有不同程度的降低,GPT降低更明显;血清PCⅢ和LN水平也显著下降(P<0.05)。RT-PCR和免疫组织化学染色证实,AdSmad7导入组大鼠肝组织Smad7表达显著上调,而α-SMA表达则明显下降(P<0.05)。病理学检查显示:AdSmad7导入组大鼠肝组织结缔组织增生程度减轻,纤维间隔变细,假小叶形成不明显,与模型对照组比较有显著性差异(P<0.05)。结论重组复制缺陷型腺病毒AdSmad7经尾静脉注射后可在大鼠肝组织中表达;外源Smad7基因可改善纤维化大鼠肝功能,降低血清PCⅢ水平,下调α-SMA表达,减轻大鼠肝纤维化程度。
- 陈颖伟王连升胡良凯张文竹李定国
- 关键词：SMAD7腺病毒载体实验性肝纤维化
