天津市科技发展战略研究计划项目(05YFGZGX02800)
- 作品数：8 被引量：24H指数：3
- 相关作者：范冬梅杨铭熊冬生张砚君王金宏更多>>
- 相关机构：中国医学科学院北京协和医学院天津医科大学中国医学科学院更多>>
- 发文基金：天津市科技发展战略研究计划项目国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 微型双功能抗体在裸鼠体内介导人T细胞杀伤白血病细胞
- 2011年
- 目的:研究抗CD3/抗CD19微型双功能抗体介导人T细胞对白血病细胞的特异性靶向杀伤活性。方法:利用Ficoll-Hypaque法分离外周血淋巴细胞(PBL),流式细胞术从中分选T淋巴细胞,FACS检测T细胞表面标记CD25和CD69激活后的表达变化,实时定量PCR检测各组穿孔素(Perforin)和颗粒酶A(Granzyme A)的释放,建立BALB/c裸鼠Raji细胞移植瘤模型,测定该双功能抗体介导的体内靶向杀伤活性。结果:激活的T细胞,双功能抗体组CD25和CD69的表达以及释放Perforin和Granzyme A的量均明显高于对照组,在对人白血病裸鼠移植瘤模型的生物治疗中,抗CD3/抗CD19微型双功能抗体能有效抑制白血病移植瘤的生长。结论:抗CD3/抗CD19微型双功能抗体在体外及动物肿瘤模型实验中能介导人T细胞有效杀伤白血病细胞,具有潜在的临床应用前景。
- 范冬梅杨铭赵英新许元富熊冬生陈礼平王敏
- 关键词：双功能抗体CD19CD3
- 双功能抗体抗CD3／抗CD19介导T细胞对靶细胞的杀伤作用被引量：3
- 2011年
- 背景与目的:双功能抗体有2个抗原结合臂,一方面具有肿瘤相关抗原,另一方面具有和免疫效应细胞表面分子标记结合的能力,并能有效地使效应细胞靶向杀灭肿瘤细胞的作用。本实验探讨抗CD3/抗CD19双功能抗体介导T细胞杀伤靶细胞的作用。方法:利用非放射性荧光染料Calcein-AM进行抗体介导的体外特异性杀伤活性检测,Ficoll-Hypaque法分离外周血淋巴细胞(peripheral blood lymphocyte,PBL),流式细胞术从中分选T淋巴细胞及CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞作为效应细胞。首先以Raji细胞为靶细胞,按不同效靶比,不同抗体浓度分组,以PBS、抗CD3scFv+、抗CD3scFv抗体及非相关抗体抗CD3/抗PGP为对照,另设CD19-K562细胞为非相关靶细胞组,比较双功能抗体介导特异性体外杀伤活性。取上述杀伤实验效靶比25∶1,抗体浓度500 ng/mL各组,ELISA法比较激活的T细胞分泌IL-2的量,Real-time PCR法检测T细胞因子IL-3、IFN-γ、TNF-α激活后的表达变化。结果:体外介导T细胞杀伤靶细胞Raji的效果比对照组明显增强(P<0.05),激活T细胞分泌IL-2、IL-3、IFN-γ及TNF-α的表达均明显高于对照组。结论:双功能抗体抗CD3/抗CD19在体外介导T细胞对靶细胞具有较强的杀伤作用。
- 范冬梅李崴杨铭赵英新许元富陈礼平王敏
- 关键词：双功能抗体CD3CD19
- 抗CD3/抗CD19微型双功能抗体的构建、表达及活性测定被引量：6
- 2010年
- 背景与目的:微型双功能抗体是基因工程抗体的一种形式,它具有两个抗原结合位点,可选择性募集效应细胞到靶细胞周围,介导特异性杀伤作用。本实验构建抗CD3/抗CD19微型双功能抗体(diabody)载体,表达纯化后测定其生物学活性。方法:用重叠PCR(overlap PCR)和PCR方法,构建抗CD3/抗CD19 diabody载体,转化感受态大肠埃希菌进行原核表达。表达产物经抗His-tag亲和层析柱分离纯化,12% SDS-PAGE电泳及Western blot鉴定。应用间接免疫荧光和竞争性免疫荧光结合流式细胞分析技术(FACS)检测生物学活性。结果:基因重组质粒经测序证实序列正确。抗CD3/抗CD19 diabody能够在原核表达系统中进行可溶性表达。12% SDS-PAGE显示28×103和26×103各有一条带,Western blot在28×103显示有条带,与预期相符。表达产物经纯化定量可达5mg/L。FACS检测抗CD3/抗CD19 diabody可与CD19+ Raji细胞和CD3+ Jurkat细胞特异结合,并能竞争性抑制HIT3a和HIT19a与上述细胞的结合活性。结论:本实验成功构建了抗CD3/抗CD19 diabody,并且能够进行可溶性表达,可与CD19+ Raji细胞和CD3+ Jurkat细胞特异结合,为以后的抗体功能实验奠定了基础。
- 李崴范冬梅程昕师锐赞刘荣任思楣王敏杨铭
- 关键词：基因工程抗体双功能抗体CD3CD19
- IL-3-LDM融合蛋白对CD123^＋白血病细胞的靶向杀伤作用被引量：3
- 2013年
- 目的:构建以IL-3为靶向、力达霉素(lidamycin,LDM)为弹头的融合蛋白IL-3-LDM,观察其对多种CD123+白血病细胞的靶向杀伤作用。方法:原核表达IL-3-LDP(interleukin 3-lidamycin)融合蛋白,组装活性烯二炔(active enediyne,AE)发色团得到IL-3-LDM。流式细胞术检测不同白血病细胞系(KG1-a、TF-1、M07e、HL-60、K562、Raji)表面CD123分子的表达,并检测融合蛋白IL-3-LDM与各白血病细胞的结合能力;CCK-8检测IL-3-LDM融合蛋白对不同CD123阳性率的白血病细胞的杀伤能力。结果:组装活性发色团得到的IL-3-LDM蛋白纯度可达90%以上。急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)KG-1a细胞表面CD123阳性率最高(88.9%),其次为MO7e和TF-1细胞(>75%),再次为HL-60细胞(7.8%),而K562、Raji细胞CD123表达呈阴性。体外IL-3-LDM融合蛋白对CD123+白血病细胞(KG-1a、MO7e、TF-1和HL-60细胞)的结合能力和杀伤效率与细胞表面CD123的阳性率成正比,对于CD123表达率最高的KG-1a细胞,LDM的杀伤强度是多柔比星(adriamycin,ADR)的1 415.8倍,而IL-3-LDM的杀伤强度又是LDM的9.6倍。结论:IL-3-LDM融合蛋白可以有效携带细胞毒药物LDM并高效靶向杀伤CD123+白血病细胞。
- 张砚君李双静姜琳琳刘荣高雪袁向飞齐怀丰范冬梅苗庆芳甄永苏熊冬生
- 关键词：IL-3力达霉素融合蛋白CD123白血病
- PHⅡ—7增强阿霉素杀伤HL-60／ADR细胞的作用及机制研究被引量：2
- 2008年
- 目的研究PHⅡ-7增强阿霉素杀伤HL-60／ADR细胞的作用及其相关机制。方法用MTT法测定阿霉素、PHⅡ-7单独及联合用药对阿霉素杀伤人急性髓系白血病耐药细胞株（HL-60／ADR）及其亲代细胞系（HL-60）作用的，IC50值，提取不同浓度PHⅡ-7处理不同时间后HL-60和HL-60／ADR细胞的RNA，RT—PCR法分析PHⅡ-7对MRP基因表达水平的影响，通过激光共聚焦显微镜和流式细胞术观察PHⅡ-7处理前后HL-60和HL-60／ADR细胞内阿霉素浓度的改变。结果PHⅡ-7本身具有抗肿瘤活性，对HL-60和HL-60／ADR的，IC50值分别为（0．83±0．08）μmol／L，（1．74±0．56）μmoL／L。PHⅡ-7还能协同提高阿霉素的细胞毒作用，HL-60组两药相互作用指数（CDI）值为0．7，HL-60／ADR组CDI值为0．43，其对耐药细胞的协同作用更为显著。随PHⅡ-7作用时间延长及剂量增加，细胞MRP基因表达水平逐渐下降，细胞内阿霉素浓度逐渐提高，可达敏感细胞的55％。结论PHⅡ-7是有效的肿瘤细胞化疗药物，还具有下调MRP耐药基因表达的作用，从而有效逆转HL-60／ADR细胞的耐药现象，协同增强化疗药物对细胞的杀伤作用。
- 张砚君王锐邵晓枫范冬梅许元富周圆刘芳刘芳苏晔
- 关键词：多药MRP基因阿霉素HL-60细胞
- 三步法制备级纯化抗CD20(Fab′)_2
- 2008年
- 目的在小规模蛋白纯化系统AKTA prime上建立制备级纯化抗CD20(Fab′)2的方法。方法将通过高渗溶液提取的周质腔蛋白抗CD20(Fab′)2依次经过离子柱、疏水柱和亲和柱纯化,采用蛋白电泳和高效液相色谱法分析检测其分离效果及纯度,同时测定其与Raji细胞的结合活性。结果在该纯化条件下一次可获得8mg纯度为96.678%的抗CD20(Fab′)2,其与CD20+Raji细胞的结合活性与采用亲和柱联合分子筛柱得到的抗体活性基本一致。结论三步法制备级纯化抗CD20(Fab′)2操作简单,能获得制备级高纯度抗CD20(Fab′)2。
- 王金宏杨铭范冬梅许元生熊冬生杨纯正
- 关键词：高效液相色谱分析
- 重组融合蛋白抗CD20Fab-LDM的构建、表达及体外活性研究被引量：4
- 2009年
- 目的构建和表达抗CD20Fab-LDP(力达霉素辅基蛋白)融合蛋白,制备强化融合蛋白抗CD20Fab-LDM(力达霉素),并测定该融合蛋白的生物学活性。方法采用PCR和overlapPCR方法构建抗CD20Fab-LDP融合蛋白,并用双脱氧终止法测定DNA序列;采用亲和层析法纯化该产物,并用Western blot鉴定纯化产物;采用FACS方法鉴定纯化产物与靶细胞的结合活性;采用冷乙二醇法制备强化融合蛋白抗CD20Fab-LDM;采用MTT法鉴定抗CD20Fab-LDM对CD20+Raji细胞特异性的细胞毒作用。结果DNA序列测定结果表明抗CD20Fab-LDP融合蛋白已构建成功,可溶性表达产物的产量可达4mg.L-1以上,具有与Raji细胞(CD20+)结合的活性,与抗CD20Fab的亲合常数相当,抗CD20Fab-LDM体外能特异性杀伤Raji细胞,IC50值为0.9×10-10mol.L-1。结论成功地构建了抗CD20Fab-LDP融合蛋白,并获得可溶性高效表达,表达产物具有与相应靶抗原结合的活性,并成功制备了抗CD20Fab-LDM强化融合蛋白,体外能特异性杀伤CD20+的Raji细胞。
- 程昕杨铭范冬梅许元富周圆高瀛岱王金宏周园李巍熊冬生
- 关键词：CD20力达霉素基因工程抗体非霍奇金淋巴瘤生物毒素
- 靶向白血病干细胞CD123的毒性融合蛋白的制备被引量：6
- 2011年
- 目的构建靶向白血病干细胞CD123的融合蛋白，检测其表达效果及其识别白血病干细胞的活性。方法采用PCR法扩增白细胞介素-3（IL-3）和毒素蛋白（LP）的编码DNA序列，经酶切、连接，克隆至表达载体pAYZ，转化大肠杆菌E-coli 16C9，鉴定阳性克隆菌落，经低磷培养基AP5诱导表达融合蛋白IL-3-G4S．LP，用CM—FF阳离子柱和抗-Etag亲和层析柱纯化，纯化产物经SDS—PAGE和Western blot鉴定，流式细胞术测定其与红白血病细胞TFl的结合活性。结果构建的融合蛋白在大肠杆菌中以可溶性蛋白表达，纯化后纯度达95％以上，表达量约为1mg／L，并有与白血病干细胞表面IL-3受体d亚基（CD123）特异性结合的活性。结论构建的融合蛋白IL-3-G4S—LP具有与白血病干细胞结合的特性，可望成为复发和耐药白血病的治疗药物。
- 任思楣张砚君彭洪薇王金宏纪庆范冬梅张楠曾洁
- 关键词：融合蛋白白细胞介素3肿瘤干细胞靶向治疗
