国家林业局948项目(2011-G35)
- 作品数：30 被引量：59H指数：5
- 相关作者：李士泽杨焕民杨国宇李昌盛孟宇更多>>
- 相关机构：黑龙江八一农垦大学河南农业大学中国农业科学院北京畜牧兽医研究所更多>>
- 发文基金：引进国际先进农业科技计划黑龙江省自然科学基金国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学生物学更多>>
- 冷应激条件下猪睾丸细胞中RNA结合基序蛋白3过表达对Caspase 3表达的影响被引量：1
- 2016年
- 目的:探讨冷应激(32℃)条件下,猪睾丸(ST)细胞系中RNA结合基序蛋白3(RBM3)过表达时凋亡蛋白半胱天冬酶3(Caspase 3)表达量变化情况。方法:利用本实验室成功构建的携带绿色荧光蛋白(GFP)的RBM3过表达慢病毒载体pLenti6/V5-GW/EmGFP-RBM3和空病毒载体pLenti6/V5-GW/EmGFP-DEST分别感染ST细胞,作为过表达病毒(OEV)组和空载体病毒(EVV)组,此外还设立野生型细胞(WTC)组作对照,利用实时荧光定量RCR(qPCR)法和Western blot分析法检测各组中RBM3 mRNA和蛋白的表达情况。然后对各组细胞进行37℃以及32℃(2 h、4 h,8 h)的冷应激处理,利用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测各组Caspase 3表达量的变化。结果:OEV组RBM3基因和蛋白相对表达量高于EVV组和WTC组。在37℃以及32℃冷应激实验(2 h、4 h,8 h)中,OEV组Caspase 3表达量显著低于EVV组和WTC组。结论:冷应激ST细胞中RBM3过表达能够显著地降低Caspase 3的表达程度,为RBM3基因具有抵抗低温诱导ST细胞凋亡作用提供实验依据。
- 李云龙李俭李昌盛李静辉孟宇杨焕民李士泽
- 关键词：冷应激过表达半胱天冬酶3
- 雏鸡冷应激前后血清中差异蛋白质组学研究被引量：3
- 2017年
- 本试验旨在比较分析雏鸡冷应激前后血清中蛋白质的表达差异,并对重点差异蛋白质进行鉴定。将30只雏鸡随机分为3组,分别为冷应激组、冷适应组和常温对照组,收集各组雏鸡的血液制备血清后进行双向凝胶电泳(2-DE),以获得血清蛋白质表达的2-DE图谱,对2-DE图谱进行差异分析(利用PDQuest 8.0软件),随后采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术对差异表达蛋白质进行鉴定,并利用蛋白质印迹(Western blot)方法进行验证。结果显示:通过2-DE对常温对照组、冷应激组和冷适应组雏鸡血清进行分析,得到了比较完整的差异蛋白质数据,共找到差异蛋白质点23个。采用MALDI-TOF-MS技术分析其中几个重复性好且较为明显的蛋白质点,成功鉴定出4个差异蛋白质,其中2个为果糖二磷酸醛缩酶C(ALDOC),是参与葡萄糖、能量代谢通路供能的相关蛋白;随后,对差异蛋白质ALDOC进行Western blot验证,所得结果与2-DE的结果相一致。结果表明,雏鸡冷应激前后血清中蛋白质的表达具有明显的差异,这些蛋白质的表达差异可能与冷应激有关。
- 杨玉英刘鹏贺军刘洋姚睿智史宏昭甄莉唐德江李士泽
- 关键词：双向电泳冷应激蛋白质组
- RBM3重组慢病毒载体的构建、包装和鉴定被引量：1
- 2014年
- 构建含有冷休克蛋白RNA结合基序蛋白3(RBM3)基因的慢病毒表达载体,产毒感染ST细胞,以评价重组慢病毒载体提高RBM3蛋白表达的效果.应用分子生物学技术提取仔猪脾脏组织的总RNA,通过反转录方法扩增RBM3基因,将其连入慢病毒载体Plenti6/v5-DEST中,在感受态细胞DH5α中扩增培养,并进行RBM3基因的测序鉴定,将重组的慢病毒质粒转染293T细胞,收获病毒液,感染293T细胞并提取细胞RNA,用逆转录PCR方法检测RBM3 mRNA在感染病毒的293T细胞中的表达,用含有慢病毒空载体pLenti6/V5-DEST的病毒液、含有重组慢病毒载体pLenti6/V5-RBM3的病毒液和无菌去离子水分别感染ST细胞后通过Western blot方法检测RBM3蛋白在感染病毒的ST细胞中的表达.结果表明:构建的慢病毒载体Plenti6/v5-RBM3经测序分析证实基因序列正确.包装后的慢病毒滴度为107 PFU/mL.逆转录PCR方法检测到感染病毒的293T细胞中,RBM3基因在转录水平上有表达,Western blot方法检测到感染病毒的ST细胞中,空载体组与空白对照组相比,RBM3蛋白表达量接近相同(分别为0.312±0.022和0.282±0.028);过表达组与空白对照组相比,RBM3蛋白表达量(0.568±0.045)显著增加(P<0.05),RBM3蛋白在翻译水平有表达.因此,本研究构建的携带RBM3基因的重组慢病毒能够感染ST细胞,并使其RBM3蛋白表达量增加.
- 李俭杨玉英李玉恒郭景茹计红郭丽李鹏杨焕民李士泽
- 关键词：冷休克蛋白慢病毒载体WESTERNBLOT
- 谷氨酰胺和L-肉碱对低温应激下AA肉仔鸡生产性能的影响
- 2013年
- 研究旨在从生产性能方面研究谷氨酰胺和L-肉碱在促进动物生长,减缓低温应激的影响,为生产实践应用抗应激添加剂提供理论依据和有益参考。采用L16(45)正交试验设计,将480只1日龄AA肉仔鸡,随机分为16组,每组3个重复,每个重复10羽肉仔鸡。谷氨酰胺添加水平分别为0%、0.4%、0.6%、0.8%,L-肉碱添加水平分别为0、50、75、100 mg.kg-1。预饲一周,试验期2周。低温条件下,在AA肉仔鸡基础日粮中联合添加谷氨酰胺和L-肉碱,显著提高了冷暴露AA肉仔鸡生产性能(p<0.05);谷氨酰胺为0.8%,L-肉碱的添加量为75 mg.kg-1对低温环境下肉仔鸡的作用效果最好。
- 王雷纪丽丽李俭申凤华刘丛计红杨焕民李士泽
- 关键词：谷氨酰胺L-肉碱
- 抗分泌性腹泻药物的研究进展被引量：1
- 2013年
- 病理性腹泻是人和动物常见疾病症状之一,长期以来控制腹泻是医学上一个重点。基于肠病原菌及其产物诱导肠道分泌的机理,许多学者开展了相应的调控研究。肠细胞仍是直接研究和开发新药的主要焦点,随着新靶位ENS和促分泌素等发现。
- 张君王月影查光明李和平
- 关键词：腹泻分泌靶位
- 冷诱导RNA结合蛋白(CIRP)过表达载体的构建及鉴定被引量：1
- 2015年
- 为构建携带冷诱导RNA结合蛋白(Cold inducible RNA-binding protein,CIRP)的过表达载体,首先从4℃条件下冷处理8 h的SD大鼠睾丸组织中获得CIRP基因的c DNA序列,然后扩增CIRP基因的编码区,将其克隆到真核表达载体p Lenti6/V5中,酶切鉴定并测序.将克隆成功的质粒转染HEK293T细胞,用Western blot检测CIRP的表达水平.成功扩增CIRP编码区,并将其克隆至载体p Lenti6/V5中;当将CIRP过表达载体转染HEK293T细胞后,Western blot检测结果显示CIRP蛋白表达水平明显增加(P<0.01).本研究成功构建了CIRP过表达载体,为进一步研究CIRP的作用机制提供了基础工具.
- 李静辉孟宇李玉恒李昌盛杨焕民李士泽
- 关键词：过表达质粒冷应激
- 猪cGAS基因的克隆与原核表达被引量：2
- 2016年
- 【目的】环磷酸鸟苷-腺苷酸合成酶(cyclic guanosine monophosphate-adenosine monophosphate synthase,c GAS)是近期在哺乳动物细胞中发现的一种新型核酸转移酶,能够识别胞质DNA,催化ATP和GTP生成第二信使c GAMP,继而通过STING依赖的方式活化转录因子IRF3,启动机体固有免疫。通过构建含猪c GAS基因的重组质粒p Bb B3a-His6-Nus A-c GAS,进行原核表达,得到c GAS蛋白,为进行体外催化合成c GAMP及探讨其在天然免疫过程中的作用奠定基础。【方法】以猪脾脏c DNA为模板克隆猪c GAS的蛋白编码区(open reading frame,ORF),用非酶连接技术将此基因克隆至丙酸诱导型原核表达载体p Bb B3a-His6-Nus A-LIC中。菌液PCR进行阳性克隆鉴定并测序。将测序鉴定正确的克隆菌液提取质粒,转化至E.coli BL21(DE3)中。当细菌生长到对数期时,丙酸钠诱导表达His6-Nus A-c GAS融合蛋白,用20 mmol·L^(-1)丙酸钠在20℃,180 r/min分别诱导0、2、4、6、8、10 h,以确定最佳诱导时间;然后,分别用0、5、10、15、20、25、30、35、40、45 mmol·L^(-1)的丙酸钠在20℃,180 r/min诱导6 h,以确定最佳诱导丙酸钠诱导浓度;另外,分别在20℃,30℃,37℃条件下用20 mmol·L^(-1)丙酸钠,180 r/min培养6 h,以确定最佳诱导温度。筛选最佳诱导条件,并用SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。【结果】(1)本试验成功克隆了猪c GAS基因,其ORF长度为1 494 bp;(2)构建了c GAS丙酸诱导型原核表达载体p Bb B3a-His6-Nus A-c GAS;(3)His6-Nus A-c GAS融合蛋白在37℃,添加20 mmol·L^(-1)丙酸钠,诱导6 h时表达量最高。(4)His6-Nus A-c GAS融合蛋白在裂解菌液的上清和沉淀中均有表达,相对分子质量为111.87 k D。【结论】运用大肠杆菌表达系统成功表达了c GAS融合蛋白,本试验为体外表达c GAS融合蛋白提供技术方法。
- 杜丽丽樊爽爽李赛赛陈佩格陈磊孙士平樊文杰王江王月影钟凯
- 关键词：原核表达
- 猪lipasin基因的克隆及其对肝细胞LPL基因转录的影响
- 2016年
- 旨在克隆猪lipasin基因,并检测其对肝细胞LPL基因转录的影响。本试验利用同源电子克隆技术克隆猪lipasin基因,构建其真核表达载体转入肝细胞,探讨其对LPL基因转录的影响。结果表明,成功克隆了猪lipasin基因,目的片段大小为615bp,上传至GenBank(登录号:KF017598),开放阅读框为594bp,编码197个氨基酸,liapsin蛋白的分子量和等电点分别为21.99ku和6.79;成功构建了真核表达载体PB-EGFP-lipasin,实现lipasin基因在肝细胞中的过表达,与对照组相比,PB-EGFP-lipasin转染的细胞中LPL基因的转录水平显著下降。结果提示,猪lipasin可能通过抑制肝细胞LPL的转录影响脂代谢。
- 李曼曼温丙言朱河水钟凯杨国宇王月影
- 关键词：克隆肝细胞LPL
- O型口蹄疫病毒衣壳蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化及电镜检测被引量：3
- 2018年
- 本试验旨在表达出高可溶性的O型口蹄疫病毒（FMDV）衣壳蛋白，并通过电镜检测，以期望形成纳米样颗粒。根据O型FMDV核酸序列，得到FMDVO／GER／Wup／82株的衣壳蛋白基因，并进行截短和优化，共133个氨基酸；同时，从肠道沙门菌（Salmonella enterica）中分离得到135个氨基酸铁蛋白（Ferritin）基因片段，将O型FMDV衣壳蛋白与铁蛋白串联，设计并合成了FMDV衣壳蛋白-铁蛋白基因片段，命名为SeFntl6599。构建了SeFnt16599融合Grifin、GST、MBP、Sumo、Thioredoxin、7-crystallin、ArsC、PpiB、CeHSP17等9种不同可溶性标签的表达重组载体。分别转化至大肠杆菌BL21（DE3）中，IPTG诱导，SDS-PAGE电泳对融合蛋白的可溶性表达进行检测，筛选出高可溶性表达的SeFnt16599融合蛋白。重组蛋白通过Ni—NTA Agarose亲和纯化，进行电镜检测。结果表明，成功构建9种SeFnt16599表达载体；9个标签中，MBP与SeFnt16599蛋白相融合的可溶性表达效果最好，并获得了高纯度的MBP—SeFnt16599重组蛋白质；电镜结果显示，MBP—SeFnt16599形成了纳米样颗粒。本试验建立了稳定获得SeFnt16599重组蛋白质的试验方法，为FMDV衣壳蛋白新型结构疫苗的开发及后续研究奠定了基础。
- 郭玉堃郭婉莹明胜利杨国宇郭豫杰
- 关键词：O型口蹄疫病毒衣壳蛋白铁蛋白融合标签可溶性
- 利用梯度PCR和降落PCR扩增CIRP基因的比较被引量：12
- 2011年
- 提取SD大鼠总RNA,同时应用降落PCR和梯度PCR在常规PCR反应体系和低模板浓度PCR反应体系中扩增CIRP基因片段,对两种方法的扩增效果进行比较。结果表明:降落PCR法可以通过一次反应即顺利扩增出CIRP基因特异性条带,并且在模板浓度降低后也能扩增出产物;梯度PCR法扩增结果不稳定,不但有非特异性条带出现而且不能检测出低浓度模板的存在。结论:降落PCR省略了梯度PCR摸索最适退火温度的过程,并且其灵敏度和特异性均高于梯度PCR。
- 李玉恒赵明慧赵紫阳李峥袁雪李昌盛林增胡婧李俭李士泽
- 关键词：降落PCR退火温度
