国家科技支撑计划(2006BAD06A09)
- 作品数：30 被引量：130H指数：6
- 相关作者：宋铭忻路义鑫韩彩霞林矫矫傅志强更多>>
- 相关机构：军事医学科学院东北农业大学中国农业科学院上海兽医研究所更多>>
- 发文基金：国家科技支撑计划国家高技术研究发展计划国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：农业科学医药卫生生物学更多>>
- 旋毛虫43ku ES抗原基因表达水平的实时荧光定量PCR检测被引量：4
- 2009年
- 根据GenBank中旋毛虫43 ku ES抗原基因(Ts43)序列设计引物和探针。以管家基因18 SrRNA为内参基因,对旋毛虫总RNA进行归一化处理,根据循环阈值(Ct值)的变化计算Ts43基因的表达量,建立检测旋毛虫Ts43表达量的实时荧光定量PCR方法,并用该方法测定旋毛虫不同寄生时期Ts43基因的表达水平。结果显示,旋毛虫Ts43基因在各寄生时期均有表达,成虫和新生幼虫Ts43基因的表达水平相对于其他寄生时期的虫体低,该基因表达量在感染后第18 d开始逐渐上升,于感染后第30 d达到高峰,而后开始逐渐下降,但感染后第58 d的虫体Ts43基因表达水平仍高于成虫和新生幼虫。结果表明,Ts43基因的表达与保姆细胞的形成有较大关系。
- 王守育路义鑫张子群韩彩霞宋铭忻
- 关键词：旋毛虫荧光定量聚合酶链式反应
- 旋毛虫实时荧光PCR检测方法的建立与应用研究被引量：8
- 2009年
- 根据旋毛虫隔离种线粒体Ls-rRNA基因序列,设计一对特异性引物及TaqMan MGB探针。以Ls-rRNA阳性重组质粒为模板,建立了旋毛虫实时荧光PCR检测方法。该检测方法对各旋毛虫隔离种具有良好的特异性,而对小鼠、狗和猪正常肌肉组织、猪鞭虫、猪蛔虫、猪钩虫、犬蛔虫等无交叉反应。最小检出量为1.32×102拷贝(10-5条旋毛虫),建立的标准曲线拟合良好,扩增方程Y=-3.43X+19.70,相关系数R2=0.9984,扩增效率为95%。平行检测组内变异系数为1.11%(n=20),同一组不同浓度梯度样本(n=9)间隔30d重复检测,结果无显著性差异。人工感染不同剂量猪旋毛虫的小鼠,在攻虫14d后检出率100%。对经压片镜检、人工胃液消化、胶体金试纸条检测结果为阴性的63份送检狗肉样本中敏感地检出8个阳性。
- 张子群谢晓峰袁金钱由轩徐义刚单琳琳宋铭忻
- 关键词：旋毛虫实时荧光PCR
- 反向遗传学技术及其在狂犬病病毒研究中的应用被引量：2
- 2008年
- 反向遗传技术是一种新兴的分子生物学技术,已广泛应用于生命科学研究的各个领域。本文综述反向遗传学技术研究进展,并讨论该技术在狂犬病病毒(Rabiesvirus,RV)研究中的应用。
- 郑学星夏咸柱杨松涛王化磊孙培录
- 关键词：反向遗传学全长CDNA狂犬病病毒
- 旋毛虫ES抗原P49基因的体外表达分析被引量：3
- 2011年
- 目的克隆和表达旋毛虫ES抗原P49基因,并分析表达产物的免疫原性。方法以重组质粒pCDNA3.1-P49为模板,PCR扩增旋毛虫ES抗原P49基因,将扩增片段双酶切产物连接到质粒pEGFP-N1中,构建重组真核表达载体pEG-FP-N1-P49,利用脂质体法将其转染哺乳动物细胞COS-7。于转染24h后在荧光显微镜下观察发绿色荧光的转基因细胞;通过Western-blot分析证实P49基因表达产物的免疫原性。结果成功构建旋毛虫ES抗原P49基因的绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1-P49,并在COS-7细胞中表达了目的蛋白,并且表达的蛋白可被感染旋毛虫小鼠阳性血清特异地识别。结论成功获得了重组蛋白,并证实该融合蛋白具有免疫原性,其结果为研究其生物学功能奠定了基础。
- 韩彩霞路义鑫李晓云朱艳梅宋铭忻
- 关键词：旋毛虫真核表达
- 日本血吸虫Sj28GST重组抗原的摇瓶发酵条件研究被引量：2
- 2009年
- 目的探索应用重组E.coliTB1摇瓶生产日本血吸虫Sj28GST重组抗原的最适工艺条件。方法用2YT培养基进行发酵,观察培养温度、种子液接种量、诱导剂异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)浓度、IPTG诱导时间等培养条件。结果培养温度为37℃,种子液接种量为10%,转速为200 r/m in,用0.8 mmol/L IPTG在开始发酵4 h后进行诱导,为最佳发酵条件。在此条件下,振荡培养17 h后,细菌密度达到吸光度(A600)值2.5,重组日本血吸虫Sj28GST产量达到21.6mg/L发酵液。结论成功探索了日本血吸虫Sj28GST重组抗原的摇瓶发酵条件。
- 沈阳林矫矫姚利晓刘金明
- 关键词：日本血吸虫摇瓶发酵
- 狂犬病病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立与初步应用被引量：6
- 2008年
- 目的建立狂犬病病毒快速检测法。方法根据狂犬病病毒核蛋白基因的保守序列分别设计两对引物及其相应的TaqMan探针。构建pMD-N重组质粒,建立荧光定量RT-PCR绝对定量标准品,并对反应体系进行优化,建立绝对定量的标准曲线。利用10倍稀释法检验方法的灵敏度并与普通RT-PCR法进行比较;作重复性和特异性检验后进行临床标本的检测。结果构建了绝对定量的参照质粒,标准曲线相关系数为0.998。狂犬病病毒荧光定量RT-PCR检测反应的灵敏度为10个TCID_(50);5种非狂犬病病原体检测均为阴性。结论建立的狂犬病病毒的荧光定量RT- PCR检测方法快速、特异性强、灵敏度高、稳定性好,可以应用于临床样品的检测。
- 郑学星杨松涛侯小强王化磊孙培录刘林立夏咸柱
- 关键词：狂犬病病毒
- 旋毛虫53ku ES重组蛋白单克隆抗体的制备及其免疫金标试纸条的研制
- 为建立一种简易、快速检测动物血清中的旋毛虫排泄分泌（Excretory-secretory,ES）抗原的胶体金免疫层析试纸法。选用旋毛虫53 ku ES重组蛋白免疫BALB/c小鼠,应用杂交瘤细胞技术制备单克隆抗体（MA...
- 路义鑫韩彩霞张子群李晓云谢晓峰赵黎黎扈炳新宋铭忻
- 关键词：旋毛虫单克隆抗体胶体金
- 文献传递
- 本地毛形线虫49ku ES重组蛋白诱发小鼠保护性免疫的研究被引量：1
- 2008年
- 目的研究本地毛形线虫肌幼虫49ku ES重组蛋白对小鼠的免疫保护作用。方法以表达的本地毛形线虫肌幼虫49ku ES重组蛋白免疫小鼠,共免疫3次。末次免疫后10d,每只小鼠攻击感染200条本地毛形线虫感染性肌幼虫,检测本地毛形线虫7日龄成虫数、雌虫体外产新生幼虫数以及感染35d肌幼虫数,并且计算减虫率,应用自制的ELISA方法测定各组小鼠血清抗体OD值。结果成虫减虫率、新生幼虫减虫率、肌幼虫减虫率分别为9.4%、70.2%和71.3%,免疫组血清抗体水平远远高于佐剂对照组和感染对照组(P<0.01)。结论本地毛形线虫肌幼虫49ku ES重组蛋白诱导小鼠产生较好的抗本地毛形线虫的保护性免疫。
- 韩周姜曰晓李继红肖文左宋铭忻路义鑫
- 关键词：本地毛形线虫KU保护性免疫
- 日本血吸虫体表蛋白rSj29的保护性效果被引量：1
- 2009年
- 目的克隆表达日本血吸虫体表蛋白Sj29基因,分析其表达特性和免疫保护效果。方法根据日本血吸虫体表蛋白Sj29基因序列(GenBank登录号为AY814537)设计引物,PCR扩增目的基因,生物信息技术分析序列特性。将目的基因部分片段亚克隆到原核表达载体pET28c中,构建重组质粒pET28c-Sj29,将其转至大肠埃希菌后用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,组氨酸(His)柱亲和层析法纯化重组蛋白;蛋白质印迹(Western blotting)分析其免疫原性。30只雌性BALB/c小鼠均分3组,实验组每鼠皮下多点注射重组蛋白rSj29共100μl(0.1mg/ml,用206佐剂配制)、佐剂对照组和空白(PBS)对照组,分别免疫3次,每次间隔2周。末次免疫后2周用血吸虫尾蚴攻击感染小鼠,每鼠40±2条,感染后第53天剖杀,收集虫体计算减虫率;取肝脏和粪便计算减卵率。ELISA法检测实验鼠血清特异性IgG抗体水平,免疫组织化学法检测rSj29蛋白在各期虫体的定位,荧光定量PCR法分析各期虫体及攻击感染后42d虫体Sj29基因表达水平。结果获得576bp的Sj29基因。重组蛋白的相对分子质量(Mr)为22900,以包涵体形式存在。Western blotting表明,重组蛋白可被免疫小鼠血清和感染日本血吸虫的小鼠血清识别。攻击感染后42d,小鼠体内Sj29基因转录水平分别为佐剂对照组和空白对照组虫体的9.1倍和51.8倍。实验组小鼠成虫数(15.4±5.9)、肝组织虫卵数(40143.3±2995.9)和粪便虫卵数(3803.9±110.9)与空白对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)。ELISA结果显示,免疫小鼠可产生高滴度(1∶32000)特异性IgG抗体。免疫组织化学结果表明,重组蛋白rSj29可在7、14d童虫,28、32d成虫和42d雄、雌虫的体表表达。荧光定量PCR结果表明,虫龄为32d的日本血吸虫成虫Sj29基因转录水平最高。结论重组蛋白rSj29有一定的免疫保护效果。
- 陈虹傅志强陈雷邱春辉付光伟李晔邵东华冯新港林矫矫
- 关键词：日本血吸虫荧光定量PCR免疫组化
- 日本血吸虫多价核酸疫苗的构建及免疫保护实验
- 利用PCR技术获得日本血吸虫GST抗原基因,通过分子克隆技术将GST,FABP基因克隆至pVAX1载体,并将其克隆至含有Sj23基因表达核的pIRESneo载体,构建重组质粒pVAX-GST,pVAX-GST-FABP,...
- 翟羽佳刘全高胜岩姜丽门静涛商立民魏峰林矫矫傅志强朱兴全
- 文献传递
