国家自然科学基金(C080501)
- 作品数：5 被引量：5H指数：1
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- 狂犬病疫苗株病毒aG株全基因序列测定及特征分析被引量：1
- 2013年
- 对我国狂犬病疫苗生产株aG株进行全基因序列测定分析,为完善aG株毒种的质量控制提供数据支持。将aG株病毒全基因组RNA分成8段进行RT-PCR分段扩增,其中基因组5′末端采取5′RACE方法,将PCR扩增产物分别克隆入pGEM-T载体中,测定序列并拼接获得病毒全基因序列;用DNAStar软件包中的相应软件对基因全序列进行分析,并与国内外主要狂犬病疫苗生产株进行基因同源性分析和主要抗原位点比较。aG株病毒基因组序列全长11 925bp(GenBank登录号为JN234411),属基因Ⅰ型狂犬病病毒;各疫苗株生物信息学分析表明,各株病毒存在同源性差异。本研究获得了aG株病毒全基因组序列,对aG株基因特征进行了分析并将其与国内外疫苗株进行了比较,为完善其质量控制提供了参考和数据支持。
- 李加曹守春石磊泰吴小红刘景华王云鹏唐建蓉俞永新董关木
- 关键词：狂犬病病毒全基因组
- 稳定表达狂犬病病毒CTN-1V株糖蛋白细胞系的建立被引量：1
- 2013年
- 目的构建能稳定表达狂犬病病毒糖蛋白的CHO细胞系。方法用RT—PCR法扩增和分离CTN-1V株狂犬病毒糖蛋白基因，测序后克隆入pCDNA5．0FRT载体，构建重组质粒pCDNA5．0FRT—G，之后与POG44质粒共转染CHO细胞，采用潮霉素B抗性筛选，挑选阳性克隆，间接免疫荧光和WesternBlot进行稳定表达细胞系的鉴定。结果经酶切和测序鉴定，获得重组表达质粒pCDNA5．0FRT—G，共转染CHO细胞后，获得肉眼可见阳性细胞克隆，刮取阳性克隆进行传代扩大培养并定义为第2代，经过10代后免疫荧光和WesternBlot结果依然阳性。结论成功建立稳定表达狂犬病病毒糖蛋白的CHO细胞系，为深入研究糖蛋白的功能奠定基础。
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- 关键词：狂犬病病毒糖蛋白类细胞系
- 狂犬病病毒核蛋白及糖蛋白在杆状病毒表达系统中的共表达及鉴定
- 2013年
- 目的利用杆状病毒表达系统共表达狂犬病病毒CTN-1V株核蛋白（nucleoprotein，NP）及糖蛋白（glycoprotein，GP）。方法RT-PCR分别扩增CTN．1V株病毒GP、NP编码区基因，分别依次克隆入转移质粒pFastBacDual的PⅢ区及P，。区构建杆状病毒重组转移质粒P—NG，转化DHl0BacE．coli感受态细胞获得重组穿梭质粒A-NG，转染Sf9细胞获得重组杆状病毒Bac-NG，高效表达目的蛋白NP、GP，进行Westernblot分析。结果重组杆状病毒穿梭质粒A-NG经PCR鉴定证明构建正确；狂犬病病毒NP、GP在重组杆状病毒感染的Sf9细胞中获得正确表达，表达的重组蛋白NP、GP相对分子质量（Mr）约为51x10^3、59x10^-；表达的重组蛋白NP、GP均可与抗RV小鼠血清特异性结合。结论成功共表达狂犬病病毒CTN-1V株NP、GP，表达产物具有良好的抗原性，为狂犬病病毒基因工程疫苗及诊断试剂的研究奠定了基础。
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- 关键词：狂犬病病毒核蛋白糖蛋白杆状病毒表达系统
- 狂犬病病毒aG株糖蛋白遗传稳定性及生物信息学分析被引量：1
- 2013年
- 目的研究狂犬病病毒(rabies virus,RV)aG株糖蛋白(glycoprotein,GP)的遗传稳定性,并对GP基因组进行序列测定及生物信息学分析。方法采用RT-PCR法扩增6代次aG株RV(4aGV4、4aGV5、4aGV7、4aGV11、4a-GV15、4aGV18)G区基因,分别将产物克隆入pGEM-T载体中,测定序列并进行拼接;测定6代次aG株RV的滴度、荧光滴度和毒力;应用DNAStar和Mega4.0软件包中的相应软件对基因组序列进行分析,并与我国近期分离且具有地域代表性的RV街毒株进行基因同源性分析。结果 6代次aG株RV GP基因保持高度稳定,未出现核苷酸突变位点;6代次aG株RV的滴度有所不同,但其毒力指标基本一致;RV aG株与我国街毒流行株GP抗原区具有较高的同源性,且膜外区同源性远高于跨膜区及膜内区;aG株RV第147位关键位点氨基酸与街毒流行株该位点不同,其余各关键抗原位点在各毒株间均高度同源;6代次aG株RV关键毒力位点均未出现氨基酸突变,传代稳定,aG株RV与各街毒流行株关键毒力位点均高度同源;aG株病毒信号肽结构与我国多株流行株高度同源,而其GP则与法国巴斯德原株PV2061株及分离自美国的HEP-Flury株高度同源,与我国流行街毒株亦具有较高的同源性。结论 RV aG株GP遗传稳定,且与我国近期分离的街毒株高度同源,本研究为完善该毒株的质量控制及全面评价其在我国的适用性提供了实验依据。
- 李加曹守春石磊泰王云鹏吴小红刘景华唐建蓉俞永新董关木
- 关键词：狂犬病病毒糖蛋白生物信息学
- 狂犬病病毒CTN-1V株糖蛋白遗传稳定性研究分析被引量：2
- 2013年
- 目的测定6代次CTN-1V株病毒糖蛋白基因组序列，并研究其致病力稳定性。方法RT-PCR方法扩增6代次CTN-1V株病毒糖蛋白基因组序列，分别将产物克隆入pGEM-T载体中，测定并拼接序列，应用DNAStar和Mega4．0软件包中的相应软件对基因组序列进行分析，并与近期我国分离且具有地域代表性的狂犬病病毒街毒株进行基因同源性分析；测定6代次CTN-1V株病毒滴度（LD卯／m1）和细胞荧光滴度（FFU／m1），采用FFU／LD∞指标来对病毒的毒力进行评价。结果6代次CTN-1V株病毒序列测定结果表明，仅第1222位的G突变为A，导致408位氨基酸由谷氨酸突变为赖氨酸，而1320位核苷酸由A突变为G，但显示为无义突变；5代次CTN-1V株病毒致病力指标均在1．00～1．07之间；糖蛋白生物信息学分析表明，CTN-1V株病毒与我国近期分离的街毒株均具有较高同源性。结论CTN-1V株病毒糖蛋白传代稳定，且与我国近期分离的街毒株高度同源，各代次CTN-1V株病毒糖蛋白基因组序列的测定及致病力研究，为完善该毒株的质量控制提供数据支持。
- 李加曹守春石磊泰王云鹏吴小红刘景华唐建蓉俞永新董关木
- 关键词：狂犬病病毒糖蛋白致病力生物信息学分析
