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实时荧光定量PCR检测恙虫病东方体被引量：13: 2006年; 目的建立检测恙虫病东方体的实时荧光定量PCR(quantitative real-ti me PCR)方法。方法根据恙虫病东方体56kD外膜蛋白基因序列设计引物和探针,以克隆的56kD基因片段作DNA模板,建立实时荧光定量PCR检测方法。结果建立的荧光定量PCR标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.999)。荧光定量PCR检测恙虫病东方体的灵敏度约为套式PCR的100倍,并且具有良好的重复性。用该定量PCR检测其它相关立克次体和病原菌DNA样本,检出结果均为0。用该定量PCR检测恙虫病东方体实验感染小鼠的血、脾脏、肺脏、肝脏标本,结果脾脏中东方体出现最早和检出量最多,肝脏和肺脏次之。血中的恙虫病东方体量较低。结论本研究建立的荧光定量PCR方法具有很高的特异性和敏感性,可用于东方体感染早期血样本的快速检测作恙虫病感染早期诊断,并且可以定量分析评价恙虫病东方体感染的程度。; 朱丽娜张晶波陈梅玲温博海牛东升李青凤孙长俭杨晓; 关键词：恙虫病东方体实时荧光定量PCR

实时荧光定量PCR检测普氏立克次体被引量：6: 2006年; 目的采用新型TaqMan-MGB探针建立检测普氏立克次体的实时荧光定量PCR方法。方法根据普氏立克次体外膜蛋白B的基因(ompB)序列设计引物和探针,以克隆的OmpB基因片段作DNA模板,在荧光定量PCR检测仪(ABI 7900型)上建立实时荧光定量检测方法。结果建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0．999)；与巢式PCR相比较,荧光定量PCR检测敏感性是其100倍。用荧光定量PCR检测莫氏立克次体及其他相关立克次体和细菌DNA,检出结果均为阴性。用荧光定量PCR检测普氏立克次体感染的豚鼠血标本,某些样本检测为阳性,而用巢式PCR检测的结果均为阴性。结论研究中建立的检测普氏立克次体实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性,适合于快速检测样本中微量普氏立克次体DNA,可用作临床实验室快速确诊流行性斑疹伤寒。; 杨晓陈梅玲温博海牛东升朱丽娜李青凤孙长俭; 关键词：流行性斑疹伤寒普氏立克次体实时定量PCR

实时荧光定量PCR检测汉赛巴通体被引量：3: 2007年; 目的采用新型TaqMan-MGB探针建立检测汉赛巴通体的实时荧光定量PCR方法。方法根据汉赛巴通体特异的16S～23SrRNA间隔区序列设计引物和探针，以克隆的16S-23SrRNA间隔区基因片段作DNA模板，在荧光定量PCR检测仪（ABI 7900HT）上建立实时荧光定量检测方法，对所建立的方法分别进行敏感性、特异性及重复性分析，并且对模拟标本进行检测。结果建立的定量标准曲线的循环阈值（Ct）与模板拷贝数呈良好的线性关系（r=0．997）；与普通PCR相比较，荧光定量PCR检测的灵敏度是其1000倍。用荧光定量PCR检测其他相关立克次体和细菌DNA样本，除军团菌检出微弱信号（2个拷贝）外，其余检出结果均为0；对重复性进行了评价，批内和批间的变异系数在0．2％～1．9％之间。用荧光定量PCR检测汉赛巴通体感染的小鼠血标本，在感染后第2天、第3天、第5天，检出少量的汉赛巴通体，在感染后的第1天和第2天从脾脏样本中检出大量的汉赛巴通体。结论检测汉赛巴通体实时荧光定量PCR方法具有高度特异性和高敏感性以及良好的重复性，可用于快速检测各种样本中的微量汉赛巴通体以及作为汉赛巴通体感染的实验室诊断。; 张晶波温博海陈梅玲李丽莉邱玲牛东升; 关键词：实时定量PCR

实时荧光定量PCR检测五日热巴通体被引量：5: 2006年; 目的采用TaqMan- MGB探针建立检测五日热巴通体的实时荧光定量PCR(real- timequantitativePCR)方法。方法根据五日热巴通体特异的16-23SrRNA间隔区序列设计引物和探针,以克隆的1623SrRNA间隔区基因片段作DNA模板,建立了检测五日热巴通体实时荧光定量检测方法。结果建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.996);与普通PCR相比较,荧光定量PCR检测的灵敏度约为它的200倍。用荧光定量PCR检测其它相关立克次体和细菌,检出结果为阴性。实时荧光定量PCR检测五日热巴通体实验感染小鼠血、脾脏、肝脏和肺组织DNA样本,脾脏和肝脏样本中检出较高水平五日热巴通体DNA,血和肺部检出的目的DNA的水平较低。结论本研究建立的检测五日热巴通体的实时荧光定量PCR法具有很高的检测灵敏度和特异性,可用于临床患者血样本的检测,作五日热的早期诊断。; 陈梅玲张晶波孙长俭温博海杨晓牛东升; 关键词：实时定量PCR 16S-23S RRNA

检测贝氏柯克斯体的实时荧光定量PCR被引量：12: 2005年; 目的采用新型TaqMan-MGB探针建立检测贝氏柯克斯体的实时荧光定量PCR(real-timequantitativePCR)方法。方法根据贝氏柯克斯体特异的23SrRNA插入基因序列设计引物和探针,以克隆的23SrRNA插入基因片段作DNA模板,在荧光定量PCR检测仪(ABI7900型)上建立实时荧光定量检测方法。结果建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.997);与套式PCR相比较,荧光定量PCR检测敏感性是其100倍。用荧光定量PCR检测其它相关立克次体,检出结果均为0。用荧光定量PCR检测贝氏柯克斯体感染的小鼠脾脏标本,脾脏中贝氏柯克斯体的感染量与感染过程具有相关性。结论本研究建立的检测贝氏柯克斯体的实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性,特别适合样本中微量贝氏柯克斯体DNA的检测,其定量检测可用于动物实验中的贝氏柯克斯体感染程度的分析。; 张晶波温博海陈梅玲邱玲牛东升李丽莉; 关键词：贝氏柯克斯体实时定量PCR RRNA

汉赛巴通体重组外膜蛋白Pap31的研制和抗原性分析被引量：2: 2008年; 目的克隆并表达汉赛巴通体Pap31外膜蛋白基因,并对其抗原性进行初步分析。方法采用PCR从汉赛巴通体基因组DNA扩增外膜蛋白基因pap31,将目的基因片段插入原核表达质粒pQE30,构建重组质粒pQE30/pap31;将构建的重组质粒转化大肠杆菌M15并诱导目的基因表达,以SDS-PAGE电泳以及免疫印迹法分析表达目的蛋白。结果在SDS-PAGE电泳分析发现pQE30/pap31转化菌高效表达一重组蛋白,经免疫印迹分析发现该蛋白与汉赛巴通体免疫血清发生强烈反应;经间接免疫荧光分析发现该重组蛋白免疫血清能特异识别汉赛巴通体。结论汉赛巴通体外膜蛋白基因pap31在大肠杆菌高效表达,表达的重组Pap31外膜蛋白具有良好的抗原性。; 王君王锡乐陈梅玲李冠武温博海; 关键词：外膜蛋白基因表达免疫反应性

荧光定量PCR检测嗜吞噬细胞无形体被引量：15: 2006年; 目的采用新型TaqMan—MGB探针建立检测嗜吞噬细胞无形体的实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR）方法。方法依据gltA基因序列设计嗜吞噬细胞无形体特异引物和探针，以克隆的嗜吞噬细胞无形体gltA基因片段作DNA模板。在荧光定量PCR检测仪（ABI 7900HT）上建立实时荧光定量检测方法。结果建立的定量标准曲线的循环闻值（Ct）与模板拷贝数呈良好的线性关系（r=0．996）；与套式PCR相比较，荧光定量PCR检测的灵敏度是其100倍。用荧光定量PCR检测其它相关立克次体和细菌DNA样本，检出结果几乎为0；对荧光定量PCR检测重复性进行分析，变异系数（CV）批内和批间误差在0-2．1％之间，证明该荧光定量PCR具有种特异性和良好的重复性。用荧光定量PCR检测体疑染嗜吞噬细胞无形体的10份蜱和30份小鼠脾脏标本，结果与套式PCR检测结果有密切相关性，但是定量PCR检测敏感性和准确率均高于套式PCR。结论本研究建立的检测嗜吞噬细胞无形体的实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性，特别适合检出样本中微量嗜吞噬细胞无形体。; 张晶波温博海陈梅玲朱丽娜邱玲牛东升; 关键词：实时定量PCR

基于ompB基因序列的立克次体精河株的系统发育分析与鉴定被引量：1: 2007年; 用PCR方法扩增新疆分离的斑点热立克次体精河株(Rickettsia sp.Jinghe)的外膜蛋白B基因(ompB)并测定其序列,将精河株ompB基因序列与其他斑点热群立克次体的ompB基因序列进行比较作系统发育分析,结果表明精河株与西伯利亚立克次体(R.sibirica)有最近的亲缘关系,但他们之间的差异水平可将精河株列为斑点热群立克次体的一个新种。; 张军焦艳梅陈梅玲温博海杨晓; 关键词：斑点热立克次体系统发育

荧光定量PCR检测查菲埃立克体被引量：2: 2006年; 依据查菲埃立克体16S rRNA基因序列设计特异性引物和TaqMan-MGB探针，以克隆的查菲埃立克体16S rRNA基因片段作DNA模板，建立实时荧光定量PCR检测方法。与套式PCR相比较，荧光定量PCR检测的灵敏度是其30倍；用荧光定量PCR检测其他相关立克次体和细菌DNA样本，检出结果为0；对荧光定量PCR检测重复性进行分析，变异系数（CV）批内和批间误差在0．2％～2．0％之间。结果证明本研究建立的荧光定量PCR方法具有种特异性和良好的重复性，可用于检测感染样本中的微量查菲埃立克体DNA。; 张晶波温博海陈梅玲杨晓李丽莉; 关键词：查菲埃立克体实时荧光定量PCR RRNA基因

实时荧光定量PCR检测斑点热立克次体的方法建立被引量：4: 2008年; 目的建立检测斑点热立克次体的群特异性实时荧光定量PCR方法。方法根据斑点热立克次体外膜蛋白B(ompB)基因序列设计群特异性引物和探针,以克隆的斑点热立克次体ompB基因片段作为模板,在荧光定量PCR检测仪上建立实时荧光定量检测法。结果该方法定量检测标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系,最小检出量小于10个拷贝。用该方法检测斑点热立克次体(立氏立克次体、西伯利亚立克次体、西伯利亚立克次体精河株、康氏立克次体、小蛛立克次体、澳大利亚立克次体、派氏立克次体、扇头蜱立克次体、非洲立克次体、阿斯特罕立克次体、斯洛伐克立克次体、日本立克次体、马赛立克次体、猫立克次体和黑龙江立克次体)DNA样本的结果均为阳性,但检测普氏立克次体、莫氏立克次体、恙虫病东方体、贝氏柯克斯体、查菲埃立克体、汉赛巴通体以及其他9种病原菌DNA样本的结果均为阴性。用荧光定量PCR检测立氏立克次体、黑龙江立克次体、西伯利亚立克次体精河株感染BALB/C小鼠脾脏组织DNA,均检出不同水平的阳性结果,结果与感染进程相关。结论本研究建立的检测斑点热立克次体的实时荧光定量PCR具有较高的敏感性和群特异性,适合样本中各种斑点热立克次体的快速检测,可用于斑点热的实验室快速诊断和自然疫源地的流行病学研究。; 牛东升杨晓陈梅玲王锡乐温博海; 关键词：斑点热聚合酶链反应

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国家科技攻关计划(2003BA712A04-07)

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