国家自然科学基金(30700701)
- 作品数：7 被引量：23H指数：3
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- 相关机构：华中科技大学温州医科大学华中科技大学同济医学院附属协和医院更多>>
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- 热休克蛋白90抑制剂17-AAG对乙型肝炎病毒复制的抑制作用被引量：1
- 2012年
- 目的探讨热休克蛋白90(HSP90)是否参与肝细胞转化生长因子(TGF)β信号通路的活化,以及HSP90对乙型肝炎病毒(HBV)复制的影响。方法 HSP90抑制剂17-AAG作用HepG2细胞,提取细胞总RNA,实时定量RT-PCR检测TGFβ下游信号分子PAI-1的表达。HepG2细胞用17-AAG预处理2 h,同时用TGFβ或TβR抑制剂SB431542作用后,将HBV复制型质粒HBV1.3转染细胞,第4 d提取HBV核心颗粒,Southern Blot检测HBV复制中间体,ELISA检测上清HBsAg的表达。结果 17-AAG能够下调HepG2细胞PAI-1的表达,HepG2细胞内HBV复制中间体表达水平明显降低,HBsAg的表达亦受到抑制,但上调或阻断TGFβ信号通路对HBV复制影响不明显。结论 HSP90参与肝细胞内TGFβ信号通路的活化,其抑制剂17-AAG能够抑制HBV的复制与蛋白表达,但该抑制作用与TGFβ信号通路活化无关。
- 柯晓煜王秋景余源刘慎沛张春燕陈妍杨燕杨东亮
- 关键词：转化生长因子Β
- Development of HBsAg-Binding Aptamers that bind HepG2.2.15 cells via HBV surface antigen被引量：6
- 2010年
- 肝炎 B 病毒表面抗原(HBsAg ) ，肝炎 B 病毒(HBV ) 的膜上的特定的抗原感染了房间，为治疗学的药提供一个完美的目标。有与 HBsAg 的高亲密关系和特性的试剂的发展具有到 HBV 感染的早阶段的诊断和治疗的大意义。此处，我们报导能明确地绑在 HBsAg 蛋白质和 HBsAg 积极的 hepatocytes 的 RNA aptamers 的选择。一高亲密关系 aptamer， HBs-A22，被孤立从一起始锝 ?.1 脳 1 的 115 mer 图书馆用 SELEX 过程的 015 个随机顺序的 RNA 分子。选择 aptamer HBs-A22 明确地跳了到表示 HBsAg 的 hepatoma 房间线 HepG2.2.15 但是没绑在 HBsAg 缺乏的 HepG2 房间。这是能绑在 HBV 特定的抗原的首先报导的 RNA aptamer。这最新孤立的 aptamer 能被修改交付成像，目标为感染 HBV 的房间的诊断、治疗学的代理人。关键词 Aptamer - 由指数的丰富(SELEX ) 的 ligands 的系统的进化 - 肝炎 B 病毒(HBV )- HBsAg - Hepatocytes 基础项目：中国(2008ZX10002-011 ) 的国家大研究节目；中国(30700701 ) 的国家自然科学基础；国家高技术研究和中国(2006AA02Z128 ) 的发展节目。
- Jia LIUYan YANGBin HUZhi-yong MAHong-ping HUANGYuan YUShen-pei LIUMeng-ji LUDong-liang YANG
- 关键词：乙肝病毒表面抗原阳性细胞乙型肝炎病毒表面抗原HBSAG
- 人宫颈癌基因小干扰RNA抑制HepG2细胞生长的作用及其机制被引量：7
- 2008年
- 目的利用RNA干扰技术探讨人宫颈癌基因（HCCR）对肝癌细胞增殖、凋亡的影响及其可能的分子机制。方法构建表达HCCR小干扰RNA的真核表达质粒pRIV2-siHCCR，将其转染肝癌细胞株HepG2细胞，定量PCR、Western blot检测HCCR及其相关基因的表达，四甲基偶氮唑盐法检测细胞增殖状态，流式细胞术观察细胞凋亡与细胞周期变化。结果成功构建真核表达质粒pRIV2-siHCCR，其表达的HCCR siRNA可有效抑制HepG2细胞内HCCR的表达，细胞增殖受到抑制，细胞凋亡增加。Western blot结果显示HCCR小干扰RNA作用HepG2细胞后。细胞内P53蛋白的表达降低，P15蛋白的表达明显升高，而PTEN、P16、P27蛋白水平没有明显改变。结论HepG2细胞中HCCR蛋白下调后，细胞增殖受到抑制，凋亡细胞增多，其作用机制可能与蛋白质P53、P15有关。
- 杨燕周学锋刘安定张正茂田拥军刘慎沛赵西平陆蒙吉杨东亮
- 关键词：蛋白质P53小干扰RNA人宫颈癌基因
- 表达HBsAg特异性siRNA的重组腺相关病毒载体的构建被引量：6
- 2010年
- 目的构建表达针对HBsAg小发卡RNA(shRNA)的重组腺相关病毒载体,以观察该病毒在体外对HBsAg和HBeAg的抑制作用。方法将表达针对HBsAg的shRNA定向克隆到pAAV/U6-hrGFP质粒中,获得重组表达质粒(pAAV-shHBs-hrGFP);采用磷酸钙转染法将该质粒与包装质粒pAAV-RC和辅助质粒pHelper共同转染AAV293细胞,进行rAAV-shHBs-hrGFP重组病毒包装。收获病毒感染HepG2.215细胞;采用ELISA法检测HBsAg和HBeAg水平。结果酶切鉴定、测序结果表明,pAAV-shHBs-hrGFP载体成功构建。包装收获的rAAV-shHBs-hrGFP病毒液可以感染HepG2.215细胞,并且可以抑制HBsAg和HBeAg的表达。结论制备的rAAV-shHBs-hrGFP病毒载体能够抑制HBV在体外的抗原表达。
- 胡斌杨燕刘嘉马智勇黄红平余源刘慎沛杨东亮
- 关键词：RNA干扰HBSAG
- 热休克蛋白90抑制乙型肝炎病毒复制的初步研究被引量：2
- 2012年
- 目的了解热休克蛋白90（HSP90）对HBV复制的影响并探讨其可能的分子机制。方法构建人HSP90真核表达质粒pXF3H-HSP90（HA—HSP90），与HBV复制型质粒HBV1．3共转HepG2细胞，ELISA检测细胞上清液HBsAg表达水平，Southemblot检测HBV复制中间体的表达。将HA—HSP90表达质粒或HSP90siRNA转染HepG2细胞，实时定量逆转录聚合酶链反应检测白细胞介素（IL）-1D、IL-6以及干扰素应答基因1（IFIT1）的表达。将TANK结合激酶1（TBK1）siRNA、HBV1．3、HA—HSP90共染HepG2细胞，Southemblot检测HBV复制中间体的表达。多组间数据比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD检验。结果成功构建了表达HSP90的真核表达质粒HA—HSP90。转染HA—HSP90的HepG2细胞内高水平表达外源蛋白，而未转染质粒的细胞内没有检测到外源蛋白的表达。转染HA-HSP90质粒组细胞上清液中的HBsAg表达量吸光度值为0．124±0．033，明显低于转染空载体pXF3H组的0．340±0．011及未转染组的0．615±0．069（F=61．013，P〈0．05）。过表达HSP90也能抑制HBV复制，转染HA-HSP90组、转染空载体pXF3H组与未转染组HBV复制中间体表达量吸光度值分别为108．92±8．59、872．45±13．00和7856．37±60．23，差异有统计学意义（F=28260．00，P〈0．05）。在HepG2细胞内高表达HSP90能诱导高水平的IFIT1产生，其中HA—HSP90组与空载体对照pXF3H组IFIT1表达的2 ^△△ CT值分别为82．139±0．919和5．579±0．644，差异有统计学意义（F=13．108，P〈0．05），但未检测到IL-1β与IL-6的诱导表达。下调HepG2细胞中干扰素信号通路分子TBK1不影响HSP90对HBV的抑制，其中HSP90组与siTBK1±HSP90组HBV复制中间体条带灰度值分别为1952．64±67．88和2366．64±71．16（F=31．30，P〉0．05）。结论HSP90能够抑制HBV的复制与蛋白表达，这种抑制作用不依赖于TBK1通路，也与IL-1β信号通路无关。
- 黄红平余源刘慎沛张春燕陈妍杨燕
- 关键词：热休克蛋白质类肝炎病毒乙型
- 胞质内DNA依赖的干扰素调节因子激活物在HBV复制中的作用被引量：1
- 2015年
- 目的观察细胞质内的DNA依赖的干扰素调节因子激活物（DAI）对HBV复制的影响，并初步探讨其影响机制。方法首先将siDAI与HBV1．3复制型质粒pHYl06共转染HepG2细胞，实验分两组：一组转染后6h，提取细胞总RNA，实时定量RT—PCR检测细胞内干扰素诱导的含三角形四肽重复蛋白（IFIT）1与白细胞介素6的表达水平。另一组在转染后第4天收集细胞上清液，酶联免疫吸附法检测HBsAg与HBeAg的表达水平；抽提细胞内的HBV核心颗粒，Southernblot检测细胞内HBV复制中间体（松弛环状DNA、双链线性DNA、单链DNA）。然后将siDAI、siTBK与HBV1．3复制型质粒DHY106共转染HeDG2细胞，同样方法检测转染后细胞上清液中HBsAg和HBeAg的表达。两组间均数比较采用独立样本t检验，多组问比较采用方差分析。结果siDAI转染导致了胞内DAI表达下调；DAI表达水平下降后HBV的复制与病毒蛋白表达受到了抑制：HBsAg和HBeAg的相对表达水平在siDAI组分别为0．0195±0．0050、0．0140±0．0040，在空白对照组为0．3150±0．0200、0．0124±0．0135，差异有统计学意义（t=14．770，P〈0．05；f=7．777，P〈0．05）；且抑制效果呈剂量依赖性。下调DAI后，对HBV诱导的IFIT1、白细胞介素6表达没有影响垆〉0．05）。同时下调DAI和TBKl后，HBV蛋白表达仍然受到抑制。结论下调DAI能抑制HBV的复制与蛋白表达，其机制与I型干扰素及核因子-kB信号通路无关。
- 王秋景李世波黄红平刘慎沛杨燕杨东亮
- 关键词：干扰素I型
- 乙型肝炎病毒影响肝细胞对双链DNA诱导产生的Ⅰ型干扰素应答
- 2012年
- 目的:了解乙型肝炎病毒(HBV)是否影响肝细胞对双链DNA(dsDNA)分子诱导产生的Ⅰ型干扰素应答。方法:以肝癌细胞HepG2以及整合有HBV基因的HepG2.2.15细胞为模型,转染dsDNA分子poly(dA-dT),实时定量RT-PCR检测IFN-β、干扰素应答基因IFIT1与炎症因子TNF-α的表达,Western blot检测NF-κB、IRF3的核转位以及pTBK1的表达。HBV复制型质粒HBV1.3转染HepG2、HBV siRNA转染HepG2.2.15后,实时定量RT-PCR检测细胞中IFIT1的表达。结果:poly(dA-dT)能够诱导HepG2细胞产生Ⅰ型干扰素,在转染后6小时,IFN-β与IFIT1表达达高峰,而后下降,TNF-α的表达与对照组相比没有明显变化。Poly(dA-dT)转染后6小时能检测到TBK1的磷酸化与IRF3的核转位,但NF-κB的核转位不明显。HepG2.2.15细胞在poly(dA-dT)转染后12小时能检测到TNF-α的一过性表达,而IFN-β与IFIT1的表达在72小时才达到高峰,与之对应的:在转染后6小时,没有检测到TBK1的磷酸化与IRF3的核转位。poly(dA-dT)与HBV1.3共转HepG2后,HBV的蛋白表达受到抑制,而将HBV siRNA转染HepG2.2.15后,细胞对poly(dA-dT)的应答明显增强。结论:HepG2与HepG2.2.15能够应对ds-DNA的刺激,通过NF-κB与IRF3信号通路产生Ⅰ型干扰素或炎症因子,但HBV的存在影响了肝细胞对dsDNA产生的固有免疫应答。
- 刘慎沛杨燕黄红平余源张春燕陈妍杨东亮
- 关键词：双链DNA固有免疫应答乙型肝炎病毒
