国家教育部博士点基金(20040610049)
- 作品数：5 被引量：2H指数：1
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- 赖型钩端螺旋体LipL32-HlyX融合基因真核表达载体的构建及在COS7细胞中融合表达的研究
- 2009年
- 从赖型钩端螺旋体017株全基因组中通过聚合酶链反应(Polymerase chain reaction,PCR)分别扩增出脂蛋白32(LipL32)和溶血素-X(HlyX)基因,应用重叠延伸PCR技术(Gene splicing by overlap extension PCR,SOEPCR)获得LipL32-HlyX融合基因。以pcDNA3.1为载体,LipL32-HlyX为目的基因,双酶切构建重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌DH5α,经双酶切、PCR及测序鉴定证实重组质粒构建成功。脂质体转染法将构建成功的重组质粒转染COS7细胞,RT-PCR扩增出约2000bp的目的基因,Western blotting分析发现在75KD处出现特异性的阳性条带。结果证实赖型钩端螺旋体LipL32-HlyX融合基因真核表达载体能在哺乳动物细胞中表达,为钩体DNA疫苗的研究和开发奠定了基础。
- 黄毕鲍朗钟琪张会东张英
- 关键词：钩端螺旋体真核表达
- 赖型钩端螺旋体017株外膜蛋白LipL32基因重组质粒的构建及其细胞毒性的研究
- 2008年
- 目的构建赖型钩端螺旋体(钩体)017株外膜蛋白LipL32基因的重组质粒,并研究其细胞毒性。方法从钩体017株全基因组中用PCR方法扩增出目的基因,双酶切构建重组质粒,转化大肠杆菌,诱导表达LipL32蛋白,将表达的目的蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,Western Blotting鉴定其免疫原性。将目的蛋白纯化、复性后作用于ECV304细胞,通过检测细胞的乳酸脱氢酶(LDH)、NO释放量研究其细胞毒性。结果扩增出816bp的LipL32基因,重组质粒经双酶切、PCR鉴定、测序均表明重组载体构建成功。经IPTG诱导表达的融合蛋白相对分子质量约52×103,主要以包涵体的形式表达,经免疫动物制备得到多克隆抗体,ELISA检测效价达1:32000,Western Blotting显示在目的蛋白位置处有特异性阳性条带。经过LipL32蛋白作用的ECV304细胞LDH、NO释放量和对照组比较有明显升高。结论成功构建LipL32基因重组质粒,该质粒能在大肠杆菌中表达,表达的目的蛋白对细胞有一定的毒性效应。
- 黄毕鲍朗钟琪商正玲张会东王中平
- 关键词：钩端螺旋体外膜蛋白LIPL32细胞毒性
- 赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体的构建及表达的初步研究
- 2008年
- 目的:构建赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体并在COS-7细胞中表达,为钩端螺旋体DNA疫苗的研究和开发奠定基础。方法:从赖型钩端螺旋体017株全基因组中PCR扩增出目的基因,双酶切构建重组质粒pcDNA3.1-LipL32。脂质体转染法将重组质粒转染COS-7细胞,通过RT-PCR、Westernblot检测目的基因的表达。结果:成功构建了LipL32基因的真核表达载体,并在COS-7细胞中获得瞬时和稳定表达。结论:赖型钩端螺旋体外膜蛋白LipL32基因真核表达载体能在哺乳动物细胞内表达,为钩端螺旋体DNA疫苗的应用提供了实验依据。
- 黄毕鲍朗钟琪商正玲张会东张英
- 关键词：钩端螺旋体真核表达
- 赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX的真核表达及基因免疫
- 2008年
- 目的在哺乳动物细胞中表达含有赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX的重组质粒，并检测其作为DNA疫苗诱导小鼠体液免疫应答的效果。方法以赖型钩端螺旋体全基因组为模板，PCR扩增出目的基因HlyX，以质粒pcDNA3．1为载体，双酶切构建重组质粒，转化大肠杆菌DH5α，双酶切、PCR及测序鉴定重组质粒。将构建成功的重组质粒转染COS-7细胞，通过RT-PCR、Western blot鉴定目的基因的表达。将重组质粒免疫BALB／c小鼠，每两周1次，共3次，ELISA法检测小鼠的体液免疫应答水平。结果扩增出全长约1100bp的HlyX基因，重组质粒经双酶切、PCR及测序鉴定表明重组质粒构建成功。RT-PCR检测显示重组质粒转染组能扩增出约1100bp的目的基因片段，Western blot分析可见在相对分子质量（Mr）40×10^3左右出现特异性的目的条带。DNA免疫后诱导小鼠产生了较高的抗体水平（1：6561～1：19683）。结论赖型钩端螺旋体溶血素基因HlyX真核表达质粒能够诱导小鼠产生高滴度的特异性抗体，为其作为钩体DNA疫苗的研究和开发奠定了基础。
- 黄毕鲍朗钟琪商正玲张会东张英
- 关键词：钩端螺旋体真核表达基因免疫
- 赖型钩端螺旋体溶血素HlyX基因的克隆、表达及其细胞毒效应被引量：2
- 2008年
- 目的:克隆、表达HlyX基因并研究其细胞毒性效应。方法:从赖型钩端螺旋体017株全基因组中用PCR方法扩增出目的基因,双酶切构建重组质粒,转化E.coliJM109,诱导表达HlyX;将表达的目的蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,Western blotting鉴定其免疫原性;将目的蛋白纯化、复性后作用于ECV304细胞,通过检测ECV304细胞乳酸脱氢酶(LDH)和一氧化氮(NO)的释放量研究目的蛋白的细胞毒性效应。结果:扩增出1179bp的目的基因HlyX,重组质粒经双酶切、PCR鉴定,测序结果表明重组质粒构建成功。经IPTG诱导表达的融合蛋白约64kD,主要以包涵体的形式表达,经免疫动物得到多克隆抗体,ELISA检测效价达1∶64000;Western blotting鉴定在目的蛋白的位置处有特异性阳性条带。经过HlyX融合蛋白作用的ECV304细胞LDH和NO释放量明显高于对照组(P<0.01)。结论:HlyX能在大肠杆菌中表达,表达的目的蛋白对细胞有毒性效应。
- 黄毕鲍朗钟琪商正玲王中平
- 关键词：钩端螺旋体属溶血素类细胞毒性
