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hTR-siRNA腺病毒的构建及其体外抗肿瘤的初步研究被引量：2: 2008年; 目的:构建RNA干扰(RNAi)腺病毒,通过体外实验观察其抑制肿瘤细胞中人端粒酶RNA(hTR)基因表达、降低瘤细胞中的端粒酶活性、以及促进肿瘤细胞凋亡等作用。方法:首先用一种新的体外连接法构建腺病毒Ad-hTR-siR-NA,表达靶向hTR的小干扰RNA分子(siRNA),用100MOI的重组腺病毒感染不同的肿瘤细胞系,再用TRAP-ELISA法测定细胞端粒酶活性、Real-timePCR测定hTR的mRNA水平、流式细胞术(FCM)测定肿瘤细胞凋亡率及人端粒酶反转录酶(hTERT)的蛋白变化。结果:感染了Ad-hTR-siRNA的肿瘤细胞的端粒酶活性明显降低,其中以HeLa细胞降低最明显,其端粒酶活性抑制率达到58.87%,hTR的mRNA表达下调70.21%,细胞凋亡率为29.7%,但hTERT的蛋白表达并不被阻断。结论:Ad-hTR-siRNA可以有效、特异地抑制hTR基因表达,诱导体外培养的肿瘤细胞凋亡,具有抗肿瘤活性;此结果提示Ad-hTR-siRNA在肿瘤基因治疗方面具有潜在的应用价值。; 李燕肖丽英姚刚李虹杨志伟李婉宜蒋忠华李明远; 关键词：HTR 腺病毒 RNA干扰端粒酶抗肿瘤作用

hTR-siRNA腺病毒对裸鼠人宫颈癌移植瘤的治疗作用被引量：1: 2008年; 目的探讨人端粒酶RNA(hTR)-siRNA腺病毒对裸鼠人宫颈癌移植瘤的治疗作用及其机制。方法将HeLa细胞注射到裸鼠的右腋皮下建立肿瘤模型,27d后将荷瘤裸鼠随机分为4组,采用瘤体内多点注射方式,分别向各组荷瘤鼠注射0.1mL的DMEM、Ad-NT-siRNA(1013pfu/L)、Ad-hTR-siRNA(1013pfu/L)或顺铂(1.20g/L),以后每隔3d注射1次,连续15d。观察注射腺病毒后移植瘤的体积变化、毒副作用。治疗结束后间隔7d处死动物,剥离出肿瘤组织称重。切取瘤组织做TUNEL染色测定组织的凋亡指数。结果将HeLa细胞移植到裸鼠皮下,成瘤率为100%。与Ad-NT-siRNA处理组相比,Ad-hTR-siRNA处理组的裸鼠移植瘤的体积和质量分别降低45.48%和34.68%,TUNEL分析显示凋亡细胞量约11.8%;但是Ad-hTR-siRNA的抗肿瘤作用不及顺铂。结论hTR-siRNA腺病毒能够明显抑制裸鼠人宫颈癌移植瘤的生长,其抗肿瘤机制与诱导肿瘤细胞凋亡、坏死有关。; 李婉宜李明远肖丽英张朝良刘豫蓉李小玉张思源李燕; 关键词：宫颈癌腺病毒 HTR基因

靶向ST6GalⅠ的siRNA与ASO联合应用对宫颈癌细胞转移能力的影响: 2007年; 目的探讨人α2,6-唾液酸转移酶(ST6GalⅠ)小分子干扰RNA(siRNA)及其与反义寡核苷酸(ASO)联合应用对ST6GalⅠ高表达的宫颈癌HeLa细胞的粘附和侵袭力的影响。方法设计并合成靶向ST6GalⅠ的siRNA及ASO,用脂质体Lipofectamine 2000包裹后转染HeLa细胞。实验分为空白对照组、脂质体对照组、siRNA组、ASO1组(与siRNA相同靶点)、ASO2组(与siRNA不同靶点)、siRNA+ASO1组及siRNA+ASO2组,用RT-PCR测定细胞中ST6GalⅠ mRNA水平,流式细胞仪检测细胞表面α2,6-唾液酸含量,分别用CytoMatrixTM细胞粘附试剂盒及细胞侵袭分析试剂盒,检测细胞对细胞外基质(ECM)的粘附与侵袭力。结果转染后各实验组细胞的ST6GalⅠ mRNA表达水平、细胞表面α2,6-唾液酸含量及细胞对ECM的粘附与侵袭力均低于空白对照组及脂质体对照组(P均<0.05),以siRNA+ASO2组调低作用最明显。其中siRNA组细胞的ST6GalⅠ mRNA表达水平(0.55±0.08)、细胞表面α2,6-唾液酸含量(39.27±9.23)分别与siRNA+ASO1组(0.54±0.09、38.27±7.74)比较,差异均无统计学意义,与siRNA+ASO2组(0.33±0.09、9.10±0.40)比较,差异有统计学意义(P均<0.05);siRNA组与siRNA+ASO1组比较,细胞对ECM的粘附与侵袭力差异均无统计学意义,而siRNA+ASO2组细胞对ECM的粘附与侵袭力较siRNA组降低(P均<0.05)。结论化学合成的靶向ST6GalⅠ的siRNA能够下调HeLa细胞中ST6GalⅠ基因的表达,继而降低细胞对ECM的粘附和侵袭力,并且与不同靶点的ASO联合应用具有相加和协同效应。; 苑天红李明远李婉宜李虹蒋忠华; 关键词：SIRNA 反义寡核苷酸宫颈肿瘤

信号肽重组mBD2在宫颈癌细胞中的稳定表达及活性测定被引量：3: 2007年; 目的探讨鼠重组beta防御素2(rmBD2)对SiHa细胞增殖的影响。方法采用脂质体转染法将真核表达质粒pcDNA3.1(+)/rmBD2转染SiHa细胞系,G418筛选出稳定表达细胞克隆。分别采用间接免疫荧光染色、RT-PCR方法检测稳定转染细胞中rmBD2蛋白和rmBD2 mRNA表达,并采用MTT法对稳定转染细胞株进行细胞增殖能力的测定。结果采用100μg/mL的G418浓度筛选质粒转染的SiHa细胞20d,得到了rmBD2稳定表达细胞株SiHa/rmBD2及转染pcDNA3.1(+)空质粒的对照细胞SiHa/K。免疫荧光染色显示SiHa/rmBD2细胞质中均有目的蛋白的表达,转染效率为100%。提取稳定转染4、6、8、10周SiHa/rmBD2细胞总RNA,RT-PCR反应扩增得到220bp左右的目的片段,而SiHa/K及SiHa细胞未见目的蛋白表达。细胞生长曲线显示SiHa/rmBD2细胞的生长速度低于SiHa/K及SiHa细胞(P<0.05)。结论本研究成功筛选了稳定表达rmBD2的细胞株SiHa/rmBD2,并采用间接免疫荧光染色、RT-PCR证实了rmBD2蛋白和rmBD2 mRNA的稳定表达,细胞增殖实验表明rmBD2可以明显抑制肿瘤细胞的增殖,为进一步研究rmBD2的抗肿瘤作用奠定了细胞学基础。; 魏晓丽李明远李虹施桥发李婉宜蒋忠华; 关键词：免疫荧光 RT-PCR 细胞生长曲线

鼠β-防御素2(mBD2)真核表达质粒的构建及稳定表达株的鉴定被引量：8: 2007年; 目的:对小鼠β防御素-2(mBD2)基因进行克隆,构建其真核表达载体,筛选出稳定表达细胞株,并研究mBD2的生物学特性及其抗肿瘤机制。方法:通过向BALB/c小鼠腹腔注射内毒素(LPS),建立小鼠急性时相反应,取其肺组织提取总RNA,采用RT-PCR方法扩增小鼠mBD2基因,经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后插入相同酶切的pcDNA3.1(+)真核表达载体,对其进行酶切和测序鉴定。将构建好的真核表达质粒pcDNA3.1(+)/mBD2转染SiHa细胞,采用G418进行稳定表达株的筛选,用免疫荧光染色和RT-PCR鉴定细胞内mBD2蛋白表达情况。结果:提取小鼠肺组织总RNA,采用RT-PCR方法扩增了250bp左右的产物,通过EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切,构建了真核表达质粒pcDNA3.1(+)/mBD2。SiHa被该质粒转染后,在100mg/LG418浓度下筛选20d,得到了稳定表达mBD2的细胞株,用免疫荧光染色显示mBD2蛋白在胞质中有大量表达,RT-PCR反应扩增到了mBD2的mRNA。结论:成功地构建了pcDNA3.1(+)/mBD2真核表达质粒,mBD2蛋白在SiHa细胞中能稳定表达,这些结果为进一步深入研究mBD2的生物学特性及其抗肿瘤的作用奠定了基础。; 魏晓丽施桥发李虹李婉宜蒋忠华李明远; 关键词：真核表达免疫荧光 RT-PCR

ST6Gal I基因特异性siRNA对SW480细胞黏附和侵袭力的影响被引量：4: 2007年; 目的:探讨人α-2,6-唾液酸转移酶(ST6GalI)小分子干扰RNA(siRNA)对ST6GalI高表达的结肠癌SW480细胞株的黏附和侵袭力的影响。方法:设计并合成ST6GalI靶向的siRNA,用脂质体Lipofectamine2000包裹后转染SW480细胞。实验设空白对照组、脂质体对照组、非特异性siRNA组和ST6GalIsiRNA组,采用RT-PCR测定细胞中ST6GalImRNA表达水平,流式细胞术检测细胞表面α-2,6-唾液酸含量,并分别用CytoMatrixTM细胞黏附试剂盒及细胞侵袭分析试剂盒,检测细胞对细胞外基质(ECM)黏附与侵袭力。结果:与空白对照组、脂质体对照组、非特异性siRNA组相比,转染48h后,ST6GalIsiRNA组细胞中ST6GalImRNA表达明显下调;转染72h后,ST6GalIsiRNA组细胞表面α-2,6-唾液酸的含量及细胞对ECM的黏附和侵袭力均明显低于其他3个对照组(P<0.05)。结论:化学合成的靶向ST6GalI的siRNA能够下调SW480细胞中ST6GalI基因的表达,降低细胞对ECM的黏附和侵袭力。本实验为进一步研究应用RNA干扰技术抗肿瘤治疗奠定基础。; 苑天红李明远李婉宜李虹蒋忠华; 关键词：SIRNA 结肠肿瘤

靶向ST6GalI的siRNA与反义寡核苷酸联合应用对结肠癌细胞转移能力的影响被引量：2: 2007年; 目的探讨人α2,6-唾液酸转移酶(ST6GalI)小分子干扰RNA(siRNA)及其与相同或不同靶点的反义寡核苷酸(ASO)联合应用,对ST6GalI高表达的结肠癌SW480细胞的粘附和侵袭力的影响。方法设计并合成靶向ST6GalI的siRNA及ASO,用脂质体Lipofectamine2000包裹后转染SW480细胞。实验分为空白对照组、脂质体对照组、siRNA组、ASO1组(与siRNA不同靶点)、ASO2组(与siRNA相同靶点)、siRNA+ASO1组及siRNA+ASO2组,应用RT-PCR测定细胞中ST6GalImRNA水平,流式细胞术检测细胞表面α2,6-唾液酸含量,分别用CytoMatrixTM细胞粘附试剂盒及细胞侵袭分析试剂盒,检测细胞对细胞外基质的粘附与侵袭力。结果siRNA组、ASO1组、ASO2组、siRNA+ASO1组、siRNA+ASO2组中,SW480细胞的ST6GalImRNA表达水平、细胞表面α2,6-唾液酸含量及细胞对ECM的粘附与侵袭力均明显低于空白对照组、脂质体对照组(P<0.05),以siRNA+ASO1组最明显,且siRNA+ASO1组与siRNA组比较,差异有统计学意义(P<0.05),而siRNA+ASO2组与siRNA组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论化学合成的靶向ST6GalI的siRNA能够下调SW480细胞中ST6GalI基因的表达,继而降低细胞对ECM的粘附和侵袭力,并且与不同靶点的ASO联合应用具有相加和协同效应。; 苑天红李明远李婉宜李虹蒋忠华; 关键词：RNA 小分子干扰反义寡核苷酸结肠肿瘤

HPV16 E7“自杀性”DNA疫苗的构建及其体外表达特性研究被引量：1: 2008年; 目的构建人乳头瘤病毒16型(HPV16)E7基因的"自杀性"DNA疫苗,并研究其体外表达能力及诱导细胞凋亡作用。方法以pET32/E7质粒为模板,用PCR方法扩增HPV16 E7基因,构建真核表达重组质粒pSCA/E7,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,将重组质粒转染BHK-21细胞,然后用免疫荧光技术检测HPV16 E7在细胞中的表达,用dUTP缺口末端标记技术(TUNEL)进行染色检测其诱导细胞凋亡作用。结果PCR扩增得到约400 bp的目的基因片段,测序结果与GenBank中的东亚型HPV16 E7基因序列100%同源。免疫荧光技术检测证实,pSCA/E7重组质粒能在BHK-21细胞中表达目的基因。TUNEL检测证实,pSCA/E7重组质粒能诱导被转染的BHK-21细胞发生凋亡。结论成功构建HPV16 E7基因的重组质粒pSCA/E7,该重组质粒可在BHK-21细胞中表达,并能诱导被转染的细胞发生凋亡。; 王红仁王保宁李婉宜左凤琼李虹蒋忠华施桥发李明远; 关键词：人乳头瘤病毒治疗性疫苗

反义ST6GalⅠ基因对HeLa细胞黏附和侵袭力的影响: 2007年; 目的研究人α2，6-唾液酸转移酶（ST6GalⅠ）反义寡核苷酸（ASODN）转染对ST6GalⅠ高表达的官颈癌HeLa细胞的黏附和侵袭力的影响。方法设计并合成靶向ST6GalⅠ的ASODN及正义寡核苷酸（SODN），用脂质体Lipofectamine 2000包裹后转染HeLa细胞。实验设空白对照组、脂质体对照组、SODN组和ASODN组。应用RT-PCR测定细胞中ST6GalⅠ mRNA水平，流式细胞术检测细胞表面α2，6-唾液酸含量，分别用CytoMatrix^TM细胞黏附试剂盒和细胞侵袭分析试剂盒，检测细胞对细胞外基质（ECM）的黏附与侵袭力。结果HeLa细胞被转染48h后，与空白对照组、脂质体对照组和SODN组相比，ASODN组细胞中ST6GalⅠ mRNA表达明显下调（P〈0．01）；与3个对照组相比，ASODN组细胞表面以，6-唾液酸的含量明显降低，同时细胞对ECM的黏附和侵袭力均降低（均P〈0．05）。结论靶向ST6GalⅠ的ASODN能下调HeLa细胞ST6GalⅠ基因的表达，降低细胞表面α2，6-唾液酸含量，继而降低细胞对ECM的黏附和侵袭力。; 苑天红李明远李婉宜李虹蒋忠华; 关键词：反义寡核苷酸宫颈肿瘤

质粒介导的RNAi抑制端粒酶活性被引量：4: 2006年; 为了探讨靶向人端粒酶反转录酶(hTERT)基因的小干扰RNA(s iRNA)表达载体是否具有抑制H eL a细胞端粒酶活性的能力,人工合成2条64个核苷酸(n t)的片段,其中19n t与hTERT基因1789-1807位碱基同源,将其退火、连接到质粒pSU PER中,构建pSU P-hTE。在pSU P-hTE基础上,把该质粒的启动子和64n t插入片段酶切、克隆到质粒pEGFP-C 1中生成pEGFP-hTE,从而获得新霉素抗性筛选质粒。将pEGFP-hTE用脂质体转染H eL a细胞,G 418筛选后获得抗性克隆并将其收获、传代,用不同方法检测hTERT的mRNA和蛋白表达水平、H eL a细胞的端粒酶活性以及细胞的增殖能力。结果显示,pEGFP-hTE转染的H eL a细胞与对照组比较,hTERT的mRNA水平下降及蛋白表达减少、细胞端粒酶活性降低38%,但细胞增殖能力没有明显改变。以上结果表明,pEGFP-hTE能通过RNA干扰(RNA i)途径特异性抑制H eL a细胞hTERT基因的表达,从而有效抑制细胞端粒酶活性,这可能将为肿瘤生物治疗提供一条新的途径。; 李燕李明远彭颖蒋中华李婉宜李虹; 关键词：PSUPER RNA干扰抑制端粒酶活性

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国家教育部博士点基金(20040610050)

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