国家自然科学基金(30571872)
- 作品数：19 被引量：69H指数：6
- 相关作者：郭风劲张树威陈安民宋登新祁军更多>>
- 相关机构：华中科技大学武汉理工大学武汉市中西医结合医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金国家教育部博士点基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- SV40T抗原基因永生化新生大鼠前软骨干细胞株的构建被引量：3
- 2007年
- 目的建立永生化大鼠前软骨干细胞(PSCs)株,为研究前软骨干细胞的分化机制及临床应用奠定基础。方法用L ipofectam ineTM2000介导基因转染,将含有SV40T抗原基因的真核表达载体pCMVSV40T/PUR导入经免疫磁珠分选出的原代PSCs进行稳定表达,用嘌呤霉素筛选出阳性克隆并扩大培养,观察细胞形态及生长状况,绘制细胞生长曲线,用免疫细胞化学方法和RT-PCR鉴定SV40T抗原基因在转染细胞中的表达。结果分离获得转化细胞阳性克隆,用免疫组化证实FGFR-3表达阳性,提取RNA后用RT-PCR法成功扩增出588 bp的片段。转染细胞经扩大培养,命名为永生化前软骨干细胞。贴壁培养的转染细胞群体倍增时间为(22.98±2.77)h,传代、冻存和复苏对细胞形态及生长无明显影响。结论在体外培养条件下,可以从新生大鼠干骺端分离、培养出前软骨干细胞,pCMVSV40T/PUR转染能使其永生化。
- 胡伟华郭风劲张树威陈安民丁然
- 关键词：前软骨干细胞细胞培养永生化
- 不同浓度血清对大鼠骨骺干细胞向软骨细胞分化的诱导效果比较被引量：6
- 2008年
- 背景:血清成分复杂,其中不仅存在促细胞生长因子,同时也存在细胞生长抑制因子,因此合适的血清浓度对于体外培养细胞的增殖和分化至关重要。目的:比较不同浓度的胎牛血清对大鼠骨骺干细胞向软骨细胞分化的影响。设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-03/10在华中科技大学同济医学院附属同济医院矫形外科研究室完成。材料:纯系清洁级新生24h内的SD大鼠8只,用于制备骨骺干细胞。胎牛血清为Gibco公司产品。方法:免疫磁珠分离纯化FGFR-3阳性的骨骺干细胞,稳定传至第3代后,分别用含1.25%,2.5%,5%,10%胎牛血清的软骨诱导培养基进行干预,诱导14d。主要观察指标:BrdU-ELISA法检测细胞增殖活性。应用免疫荧光染色和RT-PCR法检测细胞Ⅱ型胶原的表达。结果:骨骺干细胞向软骨细胞诱导14d后,10%胎牛血清组细胞增殖活性显著高于1.25%,2.5%,5%胎牛血清组(P<0.05);10%胎牛血清组Ⅱ型胶原免疫荧光染色阳性程度及Ⅱ型胶原mRNA的表达均明显强于其他3组。结论:含10%胎牛血清的软骨诱导液更有利于骨骺干细胞向软骨细胞方向分化。
- 张树威陈安民宋登新谢伯臻王江祁军易磊郭风劲
- 关键词：骨骺干细胞血清浓度分化软骨细胞
- Sox9基因促软骨形成作用机制研究进展被引量：14
- 2010年
- Sox9基因作为一个重要转录因子,在软骨形成中起着极其重要的调控作用,相关研究对软骨缺损修复等组织再生工程发展具有十分重要的意义。软骨形成过程中软骨细胞增殖、分化调控过程复杂,参与的细胞因子较多,目前比较明确的是Sox9结合于软骨细胞特异增强子Col2α1,直接调控其表达。L-Sox5、Sox6与Sox9共同形成蛋白复合物协同作用于Col2α1增强子序列,增强其转录,并通过结合于PTHrP基因的启动子区上调PTHrP基因启动子活性,刺激软骨细胞早期阶段增殖和发育。Sox9与Wnt/β-catenin和TGF-β/Smad信号转导通路相互作用,调控软骨细胞分化。最新研究显示,Sox9基因在软骨形成过程中还与其他物理因子和生物因子如低氧、电磁场等相互影响、相互作用。
- 陈少坚郭风劲
- 关键词：SOX9基因软骨形成转录因子
- Ihh信号通过甲状旁腺激素相关肽依赖和非依赖方式参与调控前软骨干细胞的分化和增殖被引量：5
- 2011年
- 目的观察印度豪猪蛋白（Ihh）和甲状旁腺激素相关肽（PTHrP）信号通路对大鼠前软骨干细胞（PSCs）分化和增殖的调控作用。方法应用免疫磁珠筛选技术获得大鼠PSCs。噻唑蓝（M3T）比色法筛选Ihh信号阻断剂环王巴明（Cyclopamine，Cyclo）的最低有效浓度，PTHrP真核质粒（pEGPF—N1-PTHrP）转染PSCs。细胞分4组：对照组（Control，PBS100μl，n=3）、Ihh信号阻断组（Ihh^-，20nmol／L Cyclo 100μl，n=3）、PTHrP信号增强组（PTHrP^＋，1．0μg pEGPF—N1-PTHrP，n=3）和双重干预组（Ihh^-／PTHrP^＋，20nmol／L Cyclo 100tμ＋1．0μg pEGPF—N1-PTHrP，n=3）。干预2周后应用逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）检测Ihh、PTHrP、Ⅱ型胶原（ColⅡ）的mRNA表达，BrdU掺入法测细胞增殖，免疫组织化学检测ColⅡ表达，阿辛蓝染色检测酸性糖胺多糖含量。结果成功获得PSCs，筛选获得Cyclo最低有效工作浓度为20nmol／L；1．0μg PTHrP真核质粒转染效率〉60％，转染后高表达该基因；Ihh^-组ColⅡ基因和蛋白表达明显下降，PTHrP^＋组和Ihh^-／PTHrP^＋组ColⅡ基因和蛋白表达稳定，酸性糖胺多糖分泌多；BrdU实验显示Ihh^-组和Ihh／PTHrP^＋组增殖率分别为（23．26±3．96）％和（21．65±5．12）％，相对Control组（35．42±3．79）％差异有统计学意义（P〈0．01），而两组间差异无统计学意义（P〉0．05）。结论Ihh-PTHrP信号通路参与对PSCs分化和增殖的调控，Ihh信号可独立调控PSCs的增殖，但对其分化的调控依赖PTHrP信号的作用。
- 许凯陈安民成薇婷郭风劲
- 关键词：前软骨干细胞信号通路分化增殖
- 骨骺干细胞复合壳聚糖／纳米羟基磷灰石支架体外培养的实验研究被引量：3
- 2009年
- 目的探讨免疫磁珠分选的骨骺干细胞（PSCs）经诱导后向软骨细胞方向分化的性能，及其与壳聚糖／纳米羟基磷灰石（CS／nHA）支架材料复合培养构建组织工程化软骨的可行性。方法用显微手术器械剪取新生24h内的清洁级SD大鼠股骨下端骺板两端的LaCroix环处组织，应用免疫磁珠分选系统分离纯化PSCs，免疫荧光染色观察PSCs成纤维细胞生长因子受体-3（FGFR-3）的表达情况。体外培养并诱导PSCs向软骨细胞特性方向分化，免疫细胞化学、甲苯胺兰及番红O染色检测诱导后细胞Ⅱ型胶原及软骨基质的表达情况。以诱导后接种于CS／nHA支架培养的PSCs为实验组，以诱导后未接种支架的细胞为对照组。扫描电镜观察细胞的黏附及形态学改变，MTT法检测细胞增殖情况，阿辛蓝法测定细胞合成的糖胺多糖（GAG）情况。对两组间不同培养时间的吸光度值及GAG进行比较。结果免疫磁珠分选的PSCs体外培养增殖迅速，免疫荧光染色显示FGFR-3阳性表达。诱导后的PSCsII型胶原免疫细胞化学染色、甲苯胺兰染色及番红O染色均呈阳性。细胞接种CS／nHA支架后1、4d，实验组与对照组吸光度值比较差异无统计学意义（P〉0．05），而7d实验组与对照组吸光度值比较差异有统计学意义（t=-2．786，P=0．024）。培养14d后培养液GAG含量为（89．664-6．52）μg／10。个细胞，高于对照组[（78．62±4．63）μg／10。个细胞）]，差异有统计学意义（t=-3．084，P〈0．05）。结论免疫磁珠分选的PSCs经诱导后可向软骨细胞功能方向分化，诱导后的PSCs与CS／nHA分层支架复合有望构建组织工程化软骨。
- 祁军陈安民郭风劲孙淑珍张树威
- 关键词：软骨干细胞壳聚糖羟基磷灰石类
- 鼠骨骺干细胞免疫纯化和pTRE-PTHrP（38-94）反应质粒的构建被引量：6
- 2008年
- 目的免疫纯化新生大鼠骨骺干细胞，克隆甲状旁腺相关蛋白的中间片段PTHrP（38-94）基因并构建四环素反应性元件调控的反应质粒pTRE-PTHrP（38-94）。方法采用免疫磁珠技术分离纯化具有FGFR-3特异性表面标志的骨骺干细胞，分别以FGFR-3抗体和PCNA抗体对骨骺干细胞的细胞爬片进行免疫细胞化学鉴定。提取骨骺干细胞的总RNA，以RT-PCR方法获得带有酶切位点PTHrP（38-94）基因片段，扩增的DNA片段与含潮霉素筛选标记的四环素反应性元件载体pTRE-2Hyg均双酶切后连接，转化、扩增后对重组质粒进行提取和酶切、测序鉴定。结果免疫荧光证实所取材分离并纯化的细胞为骨骺干细胞；经限制性内切酶Bam HⅠ、NotⅠ酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已经插入重组质粒。结论运用显微取材和免疫纯化技术可以成功分离纯化骨骺干细胞；成功克隆PTHrP（38-94）基因并构建了反应质粒pTRE-PTHrP（38-94），为进一步明确PTHrP（38-94）片段的生物学功能及其在成软骨和成骨分化过程中的作用奠定了基础。
- 张树威陈安民游洪波廖晖宋登新王江谢柏臻刘铁郭风劲
- 关键词：干细胞免疫磁化分离
- 壳聚糖/纳米羟基磷灰石分层复合支架的生物相容性研究被引量：7
- 2008年
- 制备壳聚糖/纳米羟基磷灰石(CS/nHA)分层复合支架,对其进行细胞毒性评价。分离培养大鼠软骨细胞接种于支架,相差显微镜和扫描电镜观察细胞的黏附及生长情况。动物皮下埋植试验观察其组织相容性。实验结果证实壳聚糖/纳米羟基磷灰石分层复合支架具有良好的生物相容性,有望成为较好的骨软骨组织工程支架。
- 祁军陈安民郭风劲孙淑珍谢柏臻张伟凯张树威
- 关键词：壳聚糖纳米羟基磷灰石生物相容性
- 细胞分选技术应用的研究进展
- 2011年
- 随着细胞治疗和基因治疗技术的不断发展，细胞的相关研究已经逐渐成为当前医学乃至整个生命科学领域中的研究热点，细胞培养已经成为科研中一个很重要的技术，而要获得较纯的目的细胞，细胞分选、纯化已成为关键的问题。本文就细胞分选技术及其相关原理、应用和最新的技术发展作一综述。
- 陈少坚郭风劲
- 关键词：基因治疗技术细胞治疗生命科学细胞培养
- Ihh信号通过PTHrP依赖和非依赖方式参与调节前软骨干细胞的分化和增殖
- ＜正＞目的:研究印度豪猪蛋白—甲状旁腺激素相关肽信号轴（Ihh-PTHrP pathway）对前软骨干细胞分化和增殖的调控作用。方法:应用免疫磁珠筛选技术获得大鼠前软骨干细胞（Precartilainous Stem C...
- 许凯郭风劲陈安民黄晖
- 文献传递
- 骨骺干细胞相关研究进展被引量：5
- 2007年
- 骨骺干细胞是近年来发现的保持有干细胞特性井能定向分化的成体干细胞之一,它的分离纯化使得尚未找到十分理想的种子细胞的关节软骨损伤组织工程修复研究看到了希望。研究发现PTHrP、Ihh和Notch等信号转导系统在调节骨骺干细胞分化和软骨内成骨中起着重要作用。软骨发育不良、原发性滑膜软骨瘤等多种软骨发育障碍性疾病与骨骺干细胞的特征性标记物成纤维细胞生长因子受体-3的基因突变有关。骨骺干细胞在修复软骨与骨缺损方面的研究已取得可喜进展,在未来临床研究中将有广泛的应用价值。
- 张树威郭风劲陈安民
- 关键词：骨骺干细胞分化软骨缺损修复
