中国博士后科学基金(2002032188)
- 作品数：9 被引量：7H指数：1
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- 相关机构：浙江省台州医院南京军区南京总医院南京大学更多>>
- 发文基金：中国博士后科学基金江苏省自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 血管形成素-1基因转染对血管内皮细胞影响的实验研究
- 2003年
- 目的 探讨血管形成素 1(Ang1)基因重组腺病毒 (Ad .Ang1)的获取及其对人脐静脉上皮细胞 (ECV30 4 )的影响。方法 以逆转录聚合酶链式反应 (RT PCR)自人脾组织中克隆出Ang1全长cDNA ,测序后克隆到Ad5腺病毒载体中 ,制备纯化的Ad .Ang1;以Ad .Ang1转染ECV30 4细胞 ,1至 7d后 ,用RT PCR与Westernblot分别检测ECV30 4中Ang1转录与表达情况 ,同时观测其对ECV30 4的影响。结果 克隆的Ang1DNA片段为 15 15bp的全长cDNA。所获得的Ad .Ang1与 β 半乳糖苷酶 (LacZ)基因重组腺病毒 (Ad .LacZ)滴度分别为 5 6× 10 8pfu/ml、5 3× 10 8pfu/ml。β 半乳糖苷 (X gal)染色显示LacZ基因转染Hela细胞 ,蓝染率可达 95 %以上。Ang1基因转染后第 1、3、7d可检出mRNA表达 ,第 3、7d可检测到其蛋白表达。XTT检测显示Ad .Ang1组与对照组相比 ,各时间点的OD值差异不显著 ,P >0 0 5。结论 Ad .Ang1在体外培养的ECV30 4细胞中能有效表达 ,但对ECV30
- 陈仕林景华黎介寿易龙马百坤方蓉
- 关键词：血管形成素-1基因转染血管内皮细胞腺病毒
- 复制缺陷重组腺病毒有效转染兔心包组织的实验研究
- 2004年
- 目的 观察腺病毒载体转染兔心包组织的有效性和外源性基因表达的时相性。方法 用第五代腺病毒粘粒(Adv5-CAG)为对照组或含β半乳糖苷酶基因的第五代腺病毒质粒(Adv5-CAG/LacZ)为实验组转染兔心包组织,转染后第3、7、14、28 d取被转染组织行β-半乳糖苷酶(X-gal)染色及β半乳糖苷酶活性检测。结果 X-gal染色显示实验组转染后第3、7、14、28 d注射部位心包组织均见蓝染,尤以第7 d最明显,而对照组心包组织均无蓝染;β-半乳糖苷酶活性检查示实验组转染后第3 d心包组织中即有β-半乳糖苷酶表达,7、14 d达高峰,28 d表达量明显减少。结论 重组腺病毒载体可有效地转染兔心包组织,外源性基因在兔心包组织中能够表达并能维持1个月左右。
- 陈仕林景华黎介寿易龙马百坤方蓉
- 关键词：心包转染外源性基因重组腺病毒表达量Β-半乳糖苷酶基因
- 经胸腔镜猪慢性心肌缺血模型的制作被引量：1
- 2008年
- 目的:探讨一种胸腔镜下慢性心肌缺血动物模型建立的方法。方法:23只中华实验小型猪,在完全胸腔镜下将Ameroid慢性缩窄环置于左冠状动脉回旋支(LCX)的主干,术前及术后6周分别进行冠状动脉造影检查。结果:23只猪中20只手术顺利完成,饲养6周后,行冠状动脉造影显示7只LCX完全闭塞,13只狭窄大于85%。左前降支血管增粗、迂回,多支分支伸向缺血区形成血管网。结论:完全胸腔镜下应用Ameroid慢性缩窄环可成功地制作良好的慢性心肌缺血动物模型。
- 陈仕林朱成楚唐礼江包卫光周文娟王东进
- 关键词：慢性心肌缺血动物胸腔镜
- 血管形成素1基因转染治疗兔缺血性心肌梗死的实验研究
- 2004年
- 目的 利用兔心肌梗死模型 ,探讨心肌内直接注射血管形成素 1(Ang1)重组腺病毒对缺血性心脏病的治疗作用。 方法 4 5只新西兰大白兔结扎冠状动脉 (冠脉 )制造心肌梗死模型 ,随机分为Ang1组、培养基 (DMEM )组与半乳糖苷酶基因 (LacZ)重组腺病毒组 ,心肌内分别直接注射Ang1重组腺病毒、DMEM和LacZ重组腺病毒。第 7、14、2 8d各组分别处死 5只 ,以观测心肌梗死及血管新生情况 ,术前及处死前行超声心动图检查。 结果 结扎冠脉后 7、14d ,Ang1组与LacZ组和DMEM组心肌梗死范围及新生毛细血管数差异均无显著性 ,术后 2 8d ,Ang1组心肌梗死范围显著小于LacZ组和DMEM组〔分别为 (9 1± 1 6 ) %对 (14 1± 2 2 ) %和 (13 8± 3 0 ) % ,P <0 0 1〕 ;而术后 14、2 8d新生毛细血管密度明显高于与LacZ组和DMEM组〔分别为 (10 0 7± 1 30 )个 /视野对(5 5 2± 1 0 9)个 /视野和 (5 73± 1 0 3)个 /视野 ,P <0 0 5及 (4 2 93± 6 35 )个 /视野对 (15 88±4 4 3)个 /视野和 (13 17± 1 2 9)个 /视野 ,P <0 0 1〕。心肌梗死发生 2 8d后各组的左室射血分数Ang1组改善幅度明显高于LacZ组和DMEM组〔分别为 (6 5± 6 ) %对 (4 0± 5 ) %和 (4 4± 5 ) % ,P <0 0 1〕。
- 陈仕林景华黎介寿易龙马百坤方蓉
- 关键词：基因转染超声心动图
- 胸腔镜下慢性心肌缺血模型的制备
- 2008年
- 慢性心肌缺血动物模型是冠状动脉渐进性阻塞或狭窄，由此形成的缺血性心肌病变，更加符合临床病理生理过程，因而备受关注^[1]。我们应用胸腔镜技术建立的慢性心肌缺血模型，取得良好的效果。
- 陈仕林朱成楚王东进林仙方王峥唐礼江朱广球包卫光周文娟周仪林杜丛文
- 关键词：慢性心肌缺血模型胸腔镜技术病理生理过程冠状动脉渐进性
- 转染Angiopoietin-1基因对急性心梗后左室功能的影响被引量：1
- 2005年
- 目的探讨重组腺病毒载体介导的血管形成素1(Ang1)基因转染对兔急性心梗后左室功能影响。方法构建含有Ang1的腺病毒粘粒载体,通过转染293细胞进行同源重组制备重组腺病毒颗粒。64只雄性新西兰大白兔行高位冠状动脉结扎,4只用于急性心梗后循环中VEGF含量的检测,其余60只随机均分为实验组、单纯培养基组(DMEM)与LacZ重组腺病毒组,分别于冠状动脉结扎后心肌内直接注射Ang1重组腺病毒,DMEM与LacZ重组腺病毒。并于转染后第3、14、28d应用超声心动图观察心功能情况,第3、7、14、28d应用RT PCR方法测定重组腺病毒基因在转染心肌中的表达,第14、28d用免疫组化方法观察缺血心肌内血管生长情况。结果获得的Ang1重组腺病毒滴度为5.6×1011pfu/L。重组腺病毒直接注射转染兔缺血心肌后能有效表达目的基因,RT PCR测定提示Ang1基因转染后第3d心肌中即有表达,7、14d仍呈阳性表达,28d未测出。心肌梗死后Ang1组心功能从术后第3d至第28d得到明显改善,其幅度显著好于对照组。心肌梗死后左室心肌收缩期截面积与舒张期截面积均明显增加,尤以术后第3d为著,随时间延长均有所缩小,至28d后Ang1组缩小幅度明显高于其他两组。转染14、28d后Ang1组新生毛细血管密度及αSMA阳性的小动脉性血管密度均明显高于对照组(P<0.01)。结论腺病毒介导的Ang1基因在兔缺血心肌中能有效地促进新生血管形成,并能改善缺血心肌的功能。
- 陈仕林刘玉清朱成楚叶加洪叶中瑞郭剑波叶敏华马德华
- 关键词：血管形成素-1基因治疗
- 血管生成素-1基因治疗兔心肌梗塞的实验观察被引量：1
- 2004年
- 探讨血管生成素_1(Ang1)基因经重组腺病毒介导转移促进心肌缺血区血管形成的作用 .应用共转染 2 93细胞 ,制备纯化Ang1重组腺病毒及LacZ重组腺病毒 .将Ang1重组腺病毒及LacZ重组腺病毒直接注射感染兔冠状动脉结扎后缺血心肌细胞 ,分别应用RT_PCR方法及X_gal染色测定外源基因在转导心肌中的表达 ,用免疫组化及冠状动脉造影方法观察缺血心肌内血管生长及侧支循环形成的情况 ,并用心脏超声检查观测了注射Ang1重组腺病毒后心功能变化 .结果显示重组腺病毒直接注射感染兔缺血心肌后能有效表达目的基因 ,X_gal染色显示LacZ基因转移后第 3、7、14、2 8d注射部位心肌均见蓝染 ,尤以 7d明显 ,RT_PCR测定提示Ang1基因在转移后第 3d心肌中即有表达 ,7、14d仍呈阳性表达 .转移 2 8d后新生毛细血管密度及侧支循环形成明显高于对照组 (P <0 .0 1) .心肌梗塞发生后各组的心功能随时间延长均有所改善但 14d内各组间无明显差异 ,2 8d后Ang1组改善幅度明显高于对照组 (P <0 .0 1) .本实验表明腺病毒介导的Ang1基因在兔缺血心肌中能有效表达 ,促进新生血管形成 ,改善心脏功能 .
- 陈仕林景华黎介寿易龙马百坤方蓉
- 关键词：心肌缺血血管形成素-1基因治疗
- rAAV_2VEGF_(165)与rAAV_2ANG-1联合转染促猪缺血心肌血管生成的研究被引量：3
- 2010年
- 目的:探讨联合应用血管内皮细胞生长因子(VEGF165)及血管生成素(ANG-1),对猪慢性缺血心肌中血管生成效应及心功能改善的影响。方法:完全腔镜下放置血管缩窄环于小型猪左冠状动脉回旋支(LCX),建立慢性心肌缺血模型。6周后行心电图、冠状动脉造影和心脏超声检查,确认LCX闭塞或相应心肌的缺血。16只动物随机均分为:单纯注射转染VEGF165组(组Ⅰ,n=4)、单纯注射转染ANG-1组(组Ⅱ,n=4)、联合注射转染VEGF165与ANG-1组(组Ⅲ,n=4)和注射磷酸盐缓冲液PBS对照组(组Ⅳ,n=4)。各组在胸腔镜下,心肌内直接注射rAAV2ANG-1、rAAV2VEGF165,剂量为5×1011vg(virus/genome)。治疗后,不同时间点ELISA检测VEGF165和ANG-1蛋白的分泌,冠状动脉造影观察侧枝循环形成的情况,行心脏超声检查观察左心室功能变化。3个月后取注射部位心肌,用Western blot检测VEGF165和ANG-1蛋白的表达情况,免疫组织化学观察心肌毛细血管密度与微小动脉生成情况。结果:放置血管缩窄环后6周,所有动物均出现LCX完全/次全闭塞,或LCX支配区域的心肌缺血。Ⅰ、Ⅲ两组猪体内的VEGF165蛋白分泌水平从基因转染后第7天开始上升,并于第14天达到高峰,随后逐渐下降,尤以Ⅰ组分泌水平为高;其它两组各时间点及组间的VEGF165蛋白分泌水平差异无统计学意义(P>0.05)。同样,Ⅱ、Ⅲ两组猪体内的ANG-1蛋白分泌水平的变化与VEGF165蛋白分泌水平类似,尤以Ⅱ组分泌水平为高(P<0.01);其它两组各时间点及组间的ANG-1蛋白分泌水平差异无统计学意义;组Ⅲ中VEGF165与ANG-1蛋白水平变化同步。Western blot检测显示,基因治疗后3个月,组ⅢVEGF165、ANG-1蛋白水平都显著高于组Ⅳ(P<0.01),组Ⅲ与组Ⅰ间VEGF165蛋白表达无显著差异(P>0.05),组Ⅲ与组Ⅱ间ANG-1蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。基因治疗3个月后,组Ⅲ左心室室腔缩小,心肌收缩力增强,LCX及其分支较基因转染前增�
- 朱成楚陈仕林刘玉清唐礼江林仙方包卫光马德华朱广球周文娟周仪林杜丛文
- 关键词：慢性心肌缺血血管形成素-1
- ANG-1基因重组腺相关病毒获取及转染猪骨髓干细胞的研究被引量：1
- 2009年
- 目的:构建携带血管形成素-1(ANG-1)基因腺相关病毒(AAV)载体,通过病毒包装和纯化及滴定,获得高纯度高感染性的病毒液,并转染到乳猪骨髓干细胞中,获得有效表达,为进行血管再生的基因治疗研究奠定基础。方法:利用PCR技术,获取目的基因ANG-1,通过重组DNA技术得到ANG-1与pUC119的重组质粒,采用Sal和Bgl双酶将pUC119中的目的基因ANG-1基因片断切出,再克隆到质粒pSNAV2.0中。用Lipofectamine将pSNAV ANG-1质粒转染293细胞后,用G418选择培养获得293/AAV2ANG-1细胞株,产生了有传染性的病毒颗粒,纯化并进行病毒DNA颗粒滴度测定。分别将绿色荧光蛋白(GFP)基因重组腺相关病毒(rAAV2GFP)及rAAV2ANG-1感染猪骨髓干细胞,并对转染效率及转染后表达情况进行初步研究。结果:测序证实ANG-1与GenBank提供的原始序列完全一致。重组载体经酶切鉴定与PCR筛选证实重组质粒和预期结果完全一致,在新的重组质粒中,ANG-1有一套CMV启动子和PolyA终止子系统。293细胞包装病毒效果良好,携带ANG-1的感染性AAV滴度为9×1011v.g/ml,用Western杂交法检测显示猪骨髓干细胞中表达ANG-1。1×106v.g/ml rAAV2GFP感染CD34阳性细胞48h后55%左右的细胞有明显的荧光。结论:ANG-1基因AAV构建成功,并能在骨髓干细胞中有效表达,为严重缺血性疾病基因治疗的研究奠定了基础。
- 朱成楚陈仕林刘玉清唐礼江包卫光
- 关键词：转染骨髓干细胞
