国家自然科学基金(30872758)
- 作品数：6 被引量：8H指数：1
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- EGFP—pBABE逆转录病毒载体的构建及鉴定
- 2010年
- 目的构建表达增强绿色荧光蛋白（enhancedgreenfluorescentprotein，EGFP）的EGFP—pBABE逆转录病毒载体并对其表达进行鉴定。方法从pEGFP—N3质粒上切下EGFP片段，连接到pBABE载体，构建EGFP—pBABE重组质粒；将该重组质粒转染到Fr67细胞后，荧光显微镜下观察EGFP的表达；收集逆转录病毒感染宫颈癌SiHa细胞后荧光显微镜下观察EGFP的表达。结果成功构建EGFP—pBABE重组质粒。该质粒转染PT67细胞24h后，荧光显微镜下可观察到EGFP的表达；用该重组质粒包装的逆转录病毒感染宫颈癌SiHa细胞36h后，在荧光显微镜下可观察到明显的EGFP表达。结论成功构建表达EGFP的EGFP—pBABE逆转录病毒载体，为进一步利用该载体制备逆转录病毒并观测逆转录病毒感染细胞的效率奠定了良好的实验基础。
- 刘革力袁成福张路渝卜友泉易发平马永平宋方洲
- 关键词：逆转录病毒载体
- 携带人NFBD1基因shRNA重组逆转录病毒载体的构建及鉴定
- 2009年
- 建立逆转录病毒介导的NFBD1基因RNA干扰表达体系,并观察其在宫颈癌SiHa细胞中对NFBD1表达的影响。将人NFBD1基因RNA干扰双链DNA片段重组到pSUPER Retro质粒中,构建携带人NFBD1基因RNA干扰的逆转录病毒载体pSUPER-shRNA-NFBD1,经PT67细胞包装后,产生的重组逆转录病毒感染宫颈癌细胞株SiHa细胞,并用嘌呤霉素筛选产生稳定的细胞克隆,用实时荧光定量PCR和Westernblotting检测细胞中NFBD1mRNA和蛋白表达的变化。重组逆转录病毒质粒经测序鉴定正确;逆转录病毒感染SiHa细胞后用嘌呤霉素筛选出稳定的细胞克隆;实时荧光定量PCR和Westernblot-ting检测人NFBD1mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组。携带人NFBD1基因RNA干扰双链DNA片段的逆转录病毒感染SiHa细胞后能明显抑制NFBD1mRNA和蛋白表达,为进一步研究NFBD1在宫颈癌中的作用奠定了基础。
- 程莉袁成福黄秀凝卜友泉易发平刘革力汪长东宋方洲
- 关键词：逆转录病毒载体SHRNA宫颈癌
- MKRN1基因siRNA重组腺病毒载体构建及功能鉴定
- 2009年
- 目的构建MKRN1的siRNA重组腺病毒载体，并在表达MKRN1的HeLa细胞中鉴定其干扰作用和对端粒酶活性的影响，为探讨MKRN1功能及其与肿瘤关系提供有效工具。方法人工合成靶向MKRN1的siRNA干扰序列，用分子克隆的方法克隆到穿梭载体pSES-HUS上得到pSES-HUS-MKRN1 siRNA，并与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1在BJ5183细菌中进行同源重组得到pAdeasy-SES-HUS-MKRN1 siRNA；在HEK293细胞中包装成重组腺病毒，感染表达MKRN1的HeLa细胞株，用RT-PCR法及Western印迹技术检测腺病毒对细胞MKRN1表达的影响，用PCR-TRAP法检测细胞中端粒酶活性的变化。结果成功构建了MKRN1的siR-NA重组腺病毒载体；MKRN1的siRNA重组腺病毒能显著抑制HeLa细胞中MKRN1的表达，并显著上调细胞中端粒酶的活性。结论构建的Adeasy-MKRN1 siRNA腺病毒能有效地抑制HeLa细胞中MKRN1的表达并上调细胞端粒酶活性，从而为进一步研究MKRN1的功能及其与肿瘤的关系提供了有效的新工具。
- 石艳艳刘涛张琴袁成福卜友泉易发平刘革力宋方洲
- 关键词：腺病毒载体RNA干扰端粒酶HELA细胞
- 稳定表达人JNK3的SHSY5Y细胞系的建立及鉴定
- 2009年
- 目的构建人c-jun氨基末端激酶3（c-jun N—terminal kinase 3，JNK3）真核表达载体，并在人神经母细胞瘤细胞（SHSY5Y）中稳定表达以探讨JNK3对细胞凋亡的影响。方法以pDBleu—JNK3为模板，PCR扩增人JNK3基因全长，目的片段亚克隆至真核表达载体pEGFP—C3，酶切及测序鉴定。Lipofeetamine^TM 2000转染SHSY5Y细胞，并通过G418选择性培养建立稳定表达JNK3的SHSY5Y细胞系，荧光垃微镜下观察细胞中JNK3表达，RT—PCR、Western印迹检测JNK3表达。结果成功构建了pEGFP—C3-JNK3真核表达载体，并建立了稳定表达人JNK3的SHSY5Y细胞系，与对照组相比，其人JNK3基因表达明显升高。结论稳定表达人JNK3的SHSY5Y细胞系的建立，为进一步研究人JNK3的功能及其与细胞凋亡的关系提供了重要的细胞模型和实验基础。
- 秦琴韩卿张琴卜友泉易发平宋方洲
- 关键词：细胞凋亡
- 人MDC1基因shRNA反转录病毒载体的构建及鉴定被引量：1
- 2009年
- 目的建立反转录病毒介导的MDC1基因RNA干扰表达体系并观察其在宫颈癌细胞(HeLa)中对MDC1表达的影响。方法将人MDC1基因的RNA干扰双链DNA片段重组到反转录病毒质粒pSilencer5.1-H1Retro中,构建携带人MDC1基因的RNA干扰反转录病毒载体psiRNA-MDC1。经PT67细胞包装后,产生的重组反转录病毒感染宫颈癌细胞株HeLa细胞,并用嘌呤霉素筛选稳定的细胞克隆。采用RT-PCR和Western blotting检测细胞中MDC1mRNA和蛋白表达的变化。结果重组psiRNA-MDC1质粒经测序鉴定正确;重组反转录病毒感染HeLa细胞后用嘌呤霉素筛选出稳定的细胞克隆;RT-PCR和Western blotting检测人MDC1mRNA和蛋白表达水平明显低于阴性对照组和未干扰组。结论携带人MDC1基因RNA干扰双链DNA片段的反转录病毒感染HeLa细胞后能明显抑制MDC1mRNA和蛋白表达,为进一步研究MDC1在宫颈癌中的作用奠定了基础。
- 袁成福黄秀凝程莉卜友泉刘涛刘革力易发平宋方洲
- 关键词：宫颈癌
- 应用SYBR实时荧光定量Real—TimePCR法检测人宫颈癌MCPH1 mRNA表达被引量：7
- 2011年
- 目的 应用SYBR实时荧光定量RT-PCR法检测MCPH1/BRIT1 mRNA的表达.方法 提取人宫颈癌总RNA,经逆转录PCR获得靶基因（MCPH1）及管家基因（GAPDH）的CDNA,采用SYBR Green 荧光实时定量法检测,以GAPDH基因作为内参,计算各组MCPH1 mRNA的相对表达量.结果 在31例宫颈癌标本中,MCPH1基因mRNA的表达,19例癌比正常低,1 例癌比正常高,其余标本无统计学意义;6例癌比癌旁低,1例癌比癌旁高,其余无统计学意义.结论 利用SYBR实时荧光定量RT-PCR检测出人宫颈癌中MCPH1基因mRNA的表达下调,为进一步研究MCPH1在宫颈癌中的作用及功能奠定了基础.
- 苟小燕袁成福胡仁智麦力卜友泉易发平武向梅刘革力宋方洲
- 关键词：宫颈癌
- NFBD1/MDC1表达沉默对宫颈癌细胞生长与凋亡的影响
- NFBD1/MDC1是一个参与DNA损伤应答的重要分子,近年来的研究也提示其参与肿瘤发生发展。本研究即探讨了对NFBD1/MDC1表达沉默后对宫颈癌细胞生长及凋亡的影响及其分子机制。首先构建NFBD1/MDC1 shRN...
- 袁成福卜友泉黄秀凝程莉汪长东刘革力易发平宋方洲
- 关键词：宫颈癌细胞生长细胞周期细胞凋亡
- 文献传递
