博士科研启动基金(801100010112)
- 作品数：6 被引量：18H指数：3
- 相关作者：吴华伟李相前夏帆邵蔚蓝张展更多>>
- 相关机构：长江大学淮阴工学院南京师范大学更多>>
- 发文基金：博士科研启动基金江苏省自然科学基金江苏省“青蓝工程”基金更多>>
- 相关领域：生物学轻工技术与工程农业科学更多>>
- 易错PCR定向进化大幅度提高极耐热β-葡聚糖酶的活性被引量：6
- 2010年
- 采用易错PCR方法对来自于极耐热海栖热袍菌的内切葡聚糖酶Cel1B进行定向进化。携带有Cel12B基因的重组质粒pET-20b-Cel12B在固定Mn2+浓度下,通过使用不同浓度的Mg2+优化易错PCR条件,产物构建成pET-20b-Mu-Cel12B重组子,并建立突变体文库,重组子经改进的刚果红平板法筛选,通过透明圈的大小获得了酶活性大幅度提高的突变体3个,突变基因经诱导后的酶活力分别是在同样条件下诱导获得的亲本酶的2.1倍、3.2倍和3.7倍。
- 吴华伟张展李相前李迅
- 关键词：酶活
- 表达载体pHsh对大肠杆菌热休克系统中负调控机制的影响被引量：3
- 2009年
- pHsh是一种由σ32识别和启动外源基因表达的新型高效的大肠杆菌表达载体。正常E.coli细胞在热激诱导条件下,σ32的浓度在5min内到达高峰,随后被3个负调控蛋白Dnak、DnaJ、GrpE结合导致失活或降解,整个热休克反应持续约12min。在携带有外源基因的高拷贝pHsh的E.coli细胞中,外源基因却能持续高效表达4～10h,这一现象表明了此时细胞中的σ32比没有携带质粒的细胞内σ32的浓度要高。σ32浓度的增高有可能是由于3个负调控蛋白Dnak、DnaJ、GrpE在细胞内的含量比正常情况下降低的结果。为了验证这一推测,从E.coli中克隆了Dnak、DnaJ、GrpE的编码基因,表达并初步纯化了其重组蛋白以作分子标记,采用双向电泳技术,分析携带质粒(pHsh+)和不携带质粒的E.coli(pHsh-)细胞在热休克后胞内蛋白质组的差异。该项实验通过与检索到的标准的E.coli蛋白质组图谱进行比较鉴别出的两个蛋白Dnak、GrpE,并通过对比目标点的大小和深浅发现pHsh+中的Dnak均少于pHsh─中的目标蛋白,所得结果与上述假设一致。
- 吴华伟邵蔚蓝
- 关键词：大肠杆菌调控蛋白双向电泳
- 微波-超声波协同提取烟叶中茄尼醇的工艺研究被引量：6
- 2010年
- 研究了微波-超声波协同萃取烟叶中茄尼醇的适宜条件。对温度、提取时间和萃取溶剂等影响茄尼醇提取效率的条件进行了筛选,确定了最佳的处理条件为:在50℃下,超声波开,提取溶剂为丙酮,处理时间30min,固液比1:15(W/V,g:mL)。这种方法具有萃取速度快、溶剂用量少、萃取效率高等优点。
- 吴华伟夏帆
- 关键词：茄尼醇烟叶
- 海栖热袍菌极耐热纤维二糖磷酸化酶在大肠杆菌中的克隆和表达被引量：1
- 2010年
- 将来源于极端嗜热菌属海栖热袍菌(Thermotoga maritima)的编码纤维二糖磷酸化酶的结构基因cepA与新型热激质粒pHsh连接,得到重组质粒pHsh-cepA。将重组质粒pHsh-cepA转入大肠杆菌JM109进行表达。SDS-PAGE结果显示,该重组酶的分子量为90kD,与理论值相符。基于热激载体pHsh的重组表达系统具有诱导表达简便、诱导方式廉价的优点,且重组酶热稳定性非常好。这对该酶的大规模发酵应用具有重要意义。
- 吴华伟
- 关键词：克隆
- pHsh载体对外源基因在E.coli中高效表达的机制探讨
- 2011年
- pHsh是根据大肠杆菌的热休克反应构建而成的新型表达载体,受σ32调控。正常E.coli细胞的整个热休克反应持续时间约12 min,而在携带有外源基因的高拷贝pHsh的E.coli细胞中,外源基因却能持续高效表达4 10 h。为探求外源基因高效表达的机制,以一个编码木聚糖酶的外源基因为代表,首先研究了质粒拷贝数对木聚糖酶表达的影响,接着通过Western-blot检测了携带质粒pHsh-xynIII和对照组携带pLac-xynIII的E.coli细胞在非诱导条件下(30°C)和诱导条件下(30°C→42°C)胞内σ32的差异,最后测定了不同温度下(30°C、37°C、42°C、30°C→42°C)携带质粒(pHsh-xynIII)的E.coli细胞内稳定状态下热休克的水平(以木聚糖酶活性表征)。研究结果表明外源基因在pHsh中的高效表达是与3个方面密切相关的:pHsh质粒的高拷贝数增加了外源基因的剂量;pHsh的存在使E.coli细胞内σ32的水平较正常E.coli细胞显著增加了,并最终增强了E.coli的热休克反应;诱导状态下带有pHsh重组质粒的E.coli细胞内稳定状态下的热休克水平明显高于其它温度的水平。
- 吴华伟邵蔚蓝
- 关键词：大肠杆菌热休克
- 一种快速筛选重组耐高温β-葡聚糖酶大肠杆菌的方法被引量：3
- 2009年
- 目的:建立一种快速筛选重组耐高温葡聚糖酶大肠杆菌(Escherichia coli)菌株的方法,期望以此为高通量筛选模型,通过体外定向进化后得到在不改变耐高温性能的同时提高其纤维素酶解活性的突变体。方法:以刚果红染色法为基础,带有耐高温葡聚糖酶基因cel12B重组质粒的E.coli菌株依次经过通过菌落的原位尼龙膜转印、裂解、底物和酶的高温反应、显色、脱色一系列步骤,建立了完整的筛选流程,并考察了诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)用量和加入方式、转印前重组菌的培养时间、平板上的菌落密度、筛选平板中琼脂的用量、筛选平板的孵育温度与时间对筛选效果的影响。结果:当在诱导平板上预先涂上4μL5mg/mL诱导剂IPTG,于37℃放置2-3h后,再将适当菌液涂在平板上于同样温度诱导15h并控制每个平板上的菌落密度为50个/板,筛选平板中琼脂浓度为20g/L,筛选平板的孵育温度为70℃、时间为3h时产生的透明圈形状规则、大小合适、分布均匀,筛选效果最好。
- 吴华伟夏帆李相前
- 关键词：耐高温葡聚糖酶
