国家自然科学基金(30300302)
- 作品数：15 被引量：19H指数：3
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- 嗜肺军团菌热休克蛋白60基因在大肠杆菌中的表达被引量：2
- 2006年
- 目的探讨大肠杆菌中表达嗜肺军团菌的热休克蛋白60(HSP60)的表达。方法利用聚合酶链式反应(PCR)技术扩增嗜肺军团菌HSP60基因,将其定向插入载体pUC18构建重组原核表达质粒,重组质粒转化到大肠杆菌JM109后IPTG诱导表达,并对其表达产物进行SDS-PAGE和Western-blotting分析。结果重组质粒在大肠杆菌中成功表达,可被抗军团菌抗血清识别。结论HSP60基因可在大肠杆菌中表达,并有免疫原性。
- 廖涛陈建平王涛刘明杰张建国
- 关键词：嗜肺军团菌热休克蛋白60
- 军团菌外膜蛋白抗原基因的克隆并在原核系统中表达被引量：1
- 2004年
- 目的 克隆军团菌外膜蛋白抗原基因 omp M,构建重组质粒 p LPM,并在原核系统中表达。方法 采用聚合酶链反应 (PCR)从军团菌基因组 DNA中扩增得到 omp M基因 ,导入载体 p UC1 8,在 JM1 0 9中表达 ,并用SDS-PAGE进行鉴定。结果 扩增出 773 bp的 omp M基因 ;构建重组质粒 p LPM;表达出 2 5 k Da的蛋白质。结论 成功扩增军团菌 omp M基因 ,构建重组质粒 p LPM,并在原核系统中得到了表达。
- 芦殿香陈建平张雷王涛刘明杰田玉陈宪
- 关键词：军团菌PCR基因表达
- 结核分枝杆菌RD1区Rv3873基因真核表达载体的构建及鉴定
- 2007年
- [目的]构建结核分枝杆菌RD1区Rv3873基因的真核表达载体pcDNA3.1-Rv3873,并对其进行鉴定。[方法]利用PCR技术从结核杆菌H37Rv中扩增Rv3873基因,并将其定向克隆至原核载体pGEX-4T-1中,经测序鉴定后,将重组质粒pGEX-4T-1-Rv3873中的目的基因亚克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建重组子pcDNA3.1-Rv3873,通过限制性内切酶切酶及PCR进行鉴定。[结果]克隆的Rv3873基因序列与GenBank公布的一致性为100%,限制性内切酶酶切及PCR分析表明Rv3873已成功插入pcDNA3.1(+)中。[结论]成功构建了Rv3873基因真核表达载体,为进一步研究新型结核杆菌DNA疫苗奠定了基础。
- 曾林子陈建平刘成君李红霞姚卫杨志荣
- 关键词：结核分枝杆菌真核表达载体
- 霍乱肠毒素ctxA基因真核表达重组质粒的构建及表达
- 2006年
- 目的构建霍乱肠毒素A亚单位基因(ctxA)真核表达重组质粒,并在NIH3T3细胞中进行表达。方法用限制性核酸内切酶从重组质粒pET32a-ctxA上切下ctxA基因,导入真核表达载体pcDNA3.1(+),重组子pcDNA3.1-ctxA经限制性酶切分析、PCR鉴定和序列测定正确后,用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-ctxA转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western blot对pcDNA3.1-ctxA的瞬时表达产物和稳定表达产物进行鉴定。结果重组质粒pcD-NA3.1-ctxA成功转入NIH3T3细胞,利用免疫荧光技术在NIH3T3细胞膜和细胞浆中检测到了瞬时表达,用Westernblot检测到转染的阳性细胞克隆稳定表达出约29 ku的蛋白。结论成功构建霍乱肠毒素A亚单位基因真核表达重组质粒pcDNA3.1-ctxA,并在NIH3T3细胞中表达出29 ku的CTA蛋白。
- 张莉张雷陈建平王涛
- 关键词：霍乱肠毒素转染体外表达
- 嗜肺军团菌htpA基因的克隆及其原核表达被引量：2
- 2006年
- 目的克隆并检测嗜肺军团菌htpA基因在原核系统中表达情况,为进一步研究HtpA蛋白的免疫性能作必要的准备。方法采用聚合酶链反应(PCR)从嗜肺军团菌基因组DNA中扩得军团菌热休克蛋白A基因htpA,并将其定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-1,构建原核表达重组质粒pGhtpA,重组子经限制性内切酶分析、聚合酶链式反应及测序鉴定后,转化宿主菌大肠杆菌JM109,IPTG诱导表达,产物进行SDS-PAGE电泳、免疫印迹分析鉴定。结果扩增出了291bp完整的htpA基因,构建了原核表达重组质粒pGhtpA,并检测到约36kDa的GST-htpA融合蛋白质表达条带。结论成功克隆了嗜肺军团菌htpA基因并使HtpA蛋白在原核表达系统中得到了有效的表达,为进一步研究其免疫学特性奠定了基础。
- 刘明杰陈建平廖涛王涛陈宪田玉张雷张莉
- 关键词：嗜肺军团菌基因克隆基因表达
- 霍乱肠毒素基因DNA疫苗的构建和体外表达
- 2007年
- 目的构建霍乱弧菌ctxAB融合基因分子佐剂DNA疫苗,并在NIH3T3细胞中进行表达。方法用限制性核酸内切酶从原核表达重组质粒pET32a-ctxAB上切下ctxAB基因,导入真核表达载体pcDNA3.1(+),重组子经限制性酶切分析、PCR鉴定正确后,命名为pcDNA3.1-ctxAB。用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-ctxAB转染NIH3T3细胞,采用免疫荧光法和Western blot对pcDNA3.1-ctxAB的瞬时表达产物和稳定表达产物进行鉴定。结果真核表达重组质粒pcDNA3.1-ctxAB成功转入NIH3T3细胞,利用免疫荧光技术检测到其在细胞膜和细胞浆中获得瞬时表达,对稳定转染细胞用Western blot分析,发现在约40.5kDa处有阳性杂交信号。结论成功构建霍乱弧菌ctxAB基因分子佐剂DNA疫苗,并在NIH3T3细胞中获得表达。
- 张莉张雷陈建平王涛杨志伟李金福
- 关键词：霍乱肠毒素DNA疫苗
- 嗜肺军团菌mip/ctxB融合基因动物免疫试验的免疫保护性研究被引量：3
- 2005年
- 目的初步评价mip基因DNA疫苗的免疫保护性.方法将20只6～8周龄、体重25 g左右的BALB/c雌性小鼠,随机分为空白对照组、pcDNA3.1(+)阴性对照组、pcDNA3.1-mip免疫组、pcDNA3.1-mip/ctxB免疫组4个组.每只小鼠股四头肌肌肉注射进行免疫接种,初次免疫2周后加强免疫1次,加强免疫2周后,小鼠腹腔注射嗜肺军团菌L1菌液进行攻击.攻击28 d后,检测小鼠肺组织培养带菌量和肺组织病理形态学变化.结果 pcDNA3.1-mip免疫组和pcDNA3.1-mip/ctxB免疫组肺组织培养带菌量少于空白对照组和阴性对照组(ANOVA,P＜0.05).小鼠肺组织肉眼未见明显病理变化,在显微镜下观察肺组织病理切片,发现空白对照组与阴性对照组主要表现为渗出性病变,可见肺泡膈明显增宽,肺毛细血管扩张充血,明显的中性粒细胞浸润,肺泡腔内有渗出物;而应用DNA疫苗的两个免疫组无渗出性病变,pcDNA3.1-mip免疫组肺泡壁和肺间膈轻度增厚,pcDNA3.1-mip/ctxB免疫组肺泡壁和肺泡膈略微增厚.结论应用mip基因DNA疫苗能诱导小鼠在体内产生一定的免疫保护效应.
- 王涛陈建平陈慧皎张雷廖涛
- 关键词：嗜肺军团菌免疫保护性
- 嗜肺军团菌m ip基因真核表达重组质粒构建与表达被引量：2
- 2005年
- 目的构建嗜肺军团菌m ip基因的真核表达重组质粒pcDNA 3.1-m ip,并研究其在细胞中的表达。方法PCR扩增嗜肺军团菌m ip基因,导入载体pcDNA 3.1(+),构建真核表达重组质粒pcDNA 3.1-m ip。用脂质体法将重组质粒pcDNA 3.1-m ip转染N IH 3T 3细胞,采用免疫荧光法和W estern-b lot分别鉴定pcDNA 3.1-m ip的瞬时表达产物和稳定表达产物。结果在细胞膜和细胞内观察到较强的绿色荧光,表明pcDNA 3.1-m ip成功转入N IH 3T 3细胞,并在细胞膜和细胞内获得短暂表达;用嗜肺军团菌兔血清抗体检测pcDNA 3.1-m ip稳定转染的N IH 3T 3细胞,在相对分子质量24×103处检测到阳性杂交信号,表明pcDNA 3.1-m ip在细胞内表达出M ip蛋白。空质粒pcDNA 3.1(+)转染的N IH 3T 3细胞未检测到绿色荧光和杂交信号。结论成功构建m ip基因真核表达重组质粒,并在N IH 3T 3细胞中表达出相对分子质量为24×103的M ip蛋白。
- 王涛陈建平李虹张雷陶大昌杨春蕾
- 关键词：嗜肺军团菌MIP基因转染体外表达
- 信号标签诱变突变体文库穿梭质粒构建被引量：1
- 2006年
- 目的建立信号标签诱变突变体穿梭质粒,为构建信号标签诱变突变体文库及病原微生物毒力基因筛选打下基础。方法通过PCR扩增信号标签(signature tags,STs)片段,导入载体pC6,构建重组质粒pC6RS,转化到大肠杆菌CC118中,提取重组质粒后转化到大肠杆菌S17-1中。结果经过PCR、核苷酸序列测定鉴定,成功地构建了pC6RS质粒。
- 刘德松王涛陈建平鲁芳张雷杨志伟
- 关键词：穿梭质粒病原微生物毒力基因
- 嗜肺军团菌flaA基因DNA疫苗的构建及其免疫保护性研究被引量：2
- 2007年
- 目的构建flaA基因的DNA疫苗,观察其对嗜肺军团菌感染的免疫保护作用。方法用限制性核酸内切酶从重组质粒pET32a-flaA上切下flaA基因,亚克隆到真核表达载体pcDNA3.1(+),重组子经限制性酶切分析、PCR鉴定正确后,命名为pcDNA3.1-flaA。将18只BALB/c雌性小鼠随机分为3组,pcDNA3.1-flaA实验组肌肉接种pcDNA3.1-flaA质粒100μg,2w后加强免疫一次,2个对照组分别肌肉注射等体积的生理盐水和100μg空质粒,加强免疫后3w小鼠鼻腔滴注嗜肺军团菌Lp1菌液进行攻击感染,感染4w后,检查小鼠肺组织带菌量,观察肺组织病理形态学改变。结果成功构建了真核表达重组质粒pcDNA3.1-flaA,攻击感染实验表明,pcDNA3.1-flaA免疫组肺组织带菌量显著少于生理盐水对照组和空质粒对照组(P<0.05),且肺组织病理变化症状较pcDNA3.1对照组和生理盐水对照组的肺轻微。结论由flaA基因构建的嗜肺军团菌DNA疫苗能诱导小鼠产生保护性免疫。
- 张雷张莉陈建平王涛杨志伟李金福
- 关键词：嗜肺军团菌DNA疫苗保护性免疫
