国家自然科学基金(30170704)
- 作品数：10 被引量：36H指数：4
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- 相关机构：军事医学科学院解放军军需大学成都军区联勤部更多>>
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- 狂犬病病毒核蛋白基因重组犬2型腺病毒的构建研究被引量：4
- 2005年
- 目的获得具有感染性的狂犬病病毒核蛋白犬2型腺病毒,并对重组病毒生物学和免疫学特性进行初步探讨。方法对克隆的犬2型腺病毒全基因组E3区进行部分缺失后,插入由CMV启动子、狂犬病病毒SRV9株核蛋白基因和牛生长激素polyA构成的长2392bp的表达盒,然后通过AscⅠ和PvuⅠ双酶切,游离重组全基因组,转染犬肾细胞系。结果盲传5代后,细胞产生典型病变。经鉴定,确定得到了狂犬病病毒核蛋白重组犬2型腺病毒(CAV2RN)。Westernblot检测表明,狂犬病病毒核蛋白在重组犬2型腺病毒中得到了表达。结论重组病毒可以诱导受试犬产生针对犬2型腺病毒和狂犬病病毒核蛋白的特异性抗体。
- 李海涛扈荣良张守峰肖跃强袁慧君涂长春
- 关键词：狂犬病病毒核蛋白犬2型腺病毒重组病毒
- 犬2型腺病毒E3区的克隆及其缺失改造
- 2002年
- 为构建可用于插入外源基因的犬 2型腺病毒 (CAV - 2 )E3区表达载体 ,用KpnI对CAV - 2DNA进行酶切 ,回收含E3区的KpnIB片段并将其克隆到质粒pBluescriptIIKS(+)中 ,获得了正向和反向插入的重组质粒 ,并对E3区进行了序列测定。根据E3区两末端的序列合成了两对突变引物 ,每对引物分别在E3区的 2 4 986bp及 2 6 36 0bp处各引入一个BglⅡ酶切位点。以E3区正向插入的重组质粒pBE3- 2为模板 ,分别用两对突变引物经PCR法连续进行两次点突变 ,通过BglII酶切 ,最终筛选到在E3区的首尾两端各引入一个BglII酶切位点的突变重组质粒pBEM。利用BglII酶切将E3区切除约 1 4kb的片段 ,然后在缺失部位插入了人工接头 ,接头设计了 5个单一酶切位点 ,得到的pBE3L质粒可用于外源基因的插入。
- 邱薇夏咸柱范泉水扈荣良何洪彬余春王雷高玉伟张守峰
- 关键词：犬2型腺病毒克隆
- 表达狂犬病病毒糖蛋白的重组犬2型腺病毒的构建被引量：6
- 2005年
- 本试验以犬2型腺病毒全基因组重组质粒pPolyⅡCAV 2及其E3 区重组质粒pVAX E3 为基础,通过DraⅢ和SspⅠ双酶切,缺失第25097bp 26141bp共1044bp的E3区片段,按与编码链相同转录方向插入由CMV启动子、狂犬病病毒SRV9 株糖蛋白基因、SV40 polyA基因构成的总长2424bp的表达盒,获得重组基因组质粒pPolyⅡCAV 2 CGS(34.7kb)。以AscⅠ和ClaⅠ双酶切,游离重组基因组(32.7kb),在脂质体LipofectamineTM 2000 介导下,转染MDCK细胞系,获得了E3 缺失区携带狂犬病病毒糖蛋白表达盒的重组犬2 型腺病毒CAV 2 CGS。Western印迹试验表明,CAV 2 CGS表达了狂犬病病毒糖蛋白。初步接种试验显示,重组病毒可以诱导犬产生狂犬病病毒特异性抗体。
- 张守峰扈荣良肖跃强田向阳夏咸柱
- 关键词：狂犬病病毒糖蛋白犬2型腺病毒重组病毒
- 口蹄疫病毒VP1、VP4基因核酸疫苗质粒的构建及其免疫原性被引量：7
- 2010年
- 目的构建口蹄疫病毒(FMDV)VP1、VP4基因核酸疫苗质粒,并研究其免疫原性。方法通过RT-PCR获得FMDVVP1、VP4基因,以真核表达载体pIRESneo为基础,构建VP1单表达以及VP1、VP4融合表达和共表达质粒。转染BHK-21细胞后,Western blot检测目的蛋白的表达。将上述3种基因核酸疫苗、VP1单表达与VP4单表达联合疫苗、灭活疫苗和空载体对照免疫豚鼠,检测血清特异性抗体及中和抗体水平,并进行保护力试验。结果VP1单表达,VP1、VP4融合表达及共表达质粒经PCR及酶切鉴定,证明构建正确。各组核酸疫苗质粒均能诱导产生中和抗体,且具有一定的保护效力。VP1单表达组和联合组保护率均为28.6%;共表达组和融合表达组保护率均为42.9%;灭活疫苗组保护率为100%;空载体组保护率为0。结论口蹄疫病毒VP1与VP4共存时能发挥更好的免疫原性。
- 王晓虎靳玉珠范秀波刘晔张守峰丁壮扈荣良
- 关键词：口蹄疫病毒VP1基因VP4基因核酸疫苗免疫原性
- 表达狂犬病病毒糖蛋白膜外区重组犬2型腺病毒的构建及其免疫原性研究被引量：8
- 2005年
- 为研制 1种以犬 2型腺病毒为载体的狂犬病疫苗 ,以狂犬病病毒SRV9株基因组为模板 ,通过RT_PCR技术扩增得到狂犬病病毒糖蛋白膜外区序列 ;以其为目的基因构建以CMV为启动子、SV4 0polyA为终止信号的表达盒。将犬 2型腺病毒的E3区克隆入中间质粒中 ,然后对其进行部分缺失 ,并将表达盒克隆入缺失处 ,再以此重组的E3区置换犬 2型腺病毒的E3区。以重组的犬 2型腺病毒基因组转染MDCK细胞 ,最终获得了表达盒分正向和反向插入E3区的重组犬 2型腺病毒。用两株重组腺病毒免疫幼犬 ,均在犬体内产生了针对狂犬病病毒的抗体。
- 王永志张守峰扈荣良王莘肖跃强
- 关键词：犬2型腺病毒蛋白膜RT-PCR技术MDCK细胞SV40
- 一种改进的简单快速的多位点突变方法被引量：1
- 2004年
- 为了在 1个基因序列内同时实现多个位点突变 ,本试验以犬 2型腺病毒 E3区为突变目的基因 ,建立了一种以多个引物多聚酶链式反应为基础的简单快速的多位点突变方法。首先根据需要在 E3区不同位置设计了与同一条链互补的 4条突变引物 ,在 4条引物 (PBGL、PNCO、PBST、PNOT)中分别引入了 Bgl 、Nco 、Bst B 和 Not 位点 ,与模板链核苷酸序列相比 ,每条引物内均包含了 2～ 3个突变的碱基 ;然后以含 CAV- 2 E3区基因的质粒为模板 ,利用高保真 DNA聚合酶、d NTPs和 5′末端磷酸化的 4条引物 ,在同一个 PCR反应管内进行突变 PCR反应 ,最后以 Dpn 消化反应管内模板链 ,取少许电激转化 E.coli DH10 B感受态细胞获得转化子。经上述 4种内切酶对转化子 DNA的酶切鉴定 ,证明获得了存在多种突变组合的突变基因 ,为进一步研究 E3区不同缺失对外源基因表达的影响奠定了基础 。
- 张守峰扈荣良夏咸柱
- 关键词：犬2型腺病毒聚合酶链式反应
- 狂犬病快速诊断方法的建立和应用
- 2005年
- 根据狂犬病病毒核蛋白基因保守区序列设计1对引物,建立了用于狂犬病病毒特异性核酸检测的RTPCR技术。该技术可从狂犬病病毒CVS株、8202株和SRV9株的含毒细胞培养物及鼠脑组织中,扩增出443bp的核酸片段,检出核酸的敏感性约为3pg。对30份不同种动物脑组织的检测结果与小鼠脑内接种试验(MIT)的测定结果完全吻合,但前者可在3h内直接对组织匀浆进行诊断,具有快速。
- 曹亮扈荣良张守峰单文鲁
- 关键词：狂犬病病毒RT-PCR
- 犬2型腺病毒E3区表达载体的构建被引量：1
- 2003年
- 利用构建的犬2型腺病毒E3区缺失质粒pBE3L分别构建了含有和不含外源性启动子的绿色荧光蛋白(GFP)基因和狂犬病病毒糖蛋白(Rgp)基因的重组表达质粒pBE3LGFP、pBE3LCGFP、pBE3LRgp和pBE3LCRgp,并分别对DK细胞进行了转染实验,以检测其表达,结果显示,pBE3LCGFP质粒在转染DK细胞后,于36h即可观察到荧光,72～96h无明显差别,传3代后仍可见表达荧光的细胞,pBE3LCRgp质粒转染DK细胞后,于48～96h用间接免疫荧光染色可检测到糖蛋白的表达,而pBE3LGFP和pBE3Rgp质粒转染DK细胞后经检测均无表达,表明构建的E3区缺失性载体不能利用E3区自身的启动子进行目的基因的表达,但利用外源性启动子可使外源基因获得良好表达。
- 邱薇夏咸柱范泉水扈荣良王雷高玉伟张守峰孙阳尹惠琼
- 关键词：犬2型腺病毒
- 感染性犬2型腺病毒全基因组克隆及鉴定被引量：14
- 2002年
- 以犬 2型腺病毒 (canine adenovirus type- 2 ,CAV- 2 )自然弱毒株 YCA18基因组 DNA为模板 ,经 PCR扩增分别获得其双链两末端 10 13bp(U)和 972 bp(D)的 DNA序列 ,以首尾相接方式克隆入载体 p Poly2 ,获得重组质粒p Poly2 - UD。以 Hind 和 Bst B 双酶切 p Poly2 - UD,回收含载体和部分 U、D的大片段并与 CAV- 2 DNA共转化感受态 E.coli Sure TM,经菌体内同源重组 ,获得含有 CAV- 2全基因组序列的重组质粒 p Poly2 - CAV- 2。后者以 Cla 和 Asc 双酶切 ,释放 CAV- 2全基因组 ,通过脂质体介导转染 MDCK细胞 ,盲传 3代后重复转染 1次 ,4d后 ,出现腺病毒典型病变。细胞上清血凝效价为 1∶ 6 40 ,并可被 CAV- 2抗血清有效抑制。以上结果表明 ,本研究获得了具有感染性的CAV- 2全基因组重组质粒 ,为以 CAV- 2作为重组疫苗载体的系列研究奠定了重要基础。
- 张守峰扈荣良牛建强夏咸柱
- 关键词：犬2型腺病毒同源重组基因克隆
- 猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白-重组犬1型腺病毒构建及在猪体内免疫特性被引量：2
- 2009年
- 本试验根据猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）基因组GP5蛋白的免疫原性，将PRRSV河北分离株GP5基因的表达盒克隆到犬1型腺病毒的感染性基因组的复制非必需区内，转染MDCK细胞，获得了重组病毒，免疫新生仔猪，分别在免疫后O～12周采集血清，通过ELISA检测证明，猪体同时产生了针对犬1型腺病毒和PRRSV GP5的抗体。说明GP5-重组犬1型腺病毒具有作为蓝耳病疫苗的潜力。
- 蒋万春赵德明
- 关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5蛋白免疫
