重庆市自然科学基金(2006BB5093)
- 作品数：2 被引量：5H指数：1
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- 相关领域：生物学医药卫生更多>>
- 人重组蛋白P311的原核表达纯化与鉴定被引量：1
- 2008年
- 目的原核表达人增生性瘢痕新候选相关蛋白P311,并对该重组蛋白进行纯化、鉴定。方法通过PCR方法扩增人P311基因,利用BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点将其克隆至谷胱甘肽-S-转移酶(glutathione-s-transferase,GST)融合蛋白表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3)后,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-β-D-5-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,用SDS-PAGE、Western blotting等方法鉴定表达产物,并用谷胱甘肽-琼脂糖小珠亲和纯化表达的GST-P311蛋白。结果重组载体pGEX-4T-P311经酶切与测序鉴定证实构建成功。导入大肠杆菌进行表达,表达产物相对分子量为34KD左右,与预期值相符。该条带经免疫印迹检测鉴定为GST抗体阳性,获得了纯化的GST-P311蛋白。结论构建了pGEX-4T-P311原核表达载体,并在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达,亲和纯化获得较高纯度的GST融合蛋白,为下一步继续研究P311的生物学功能奠定了基础。
- 谭江琳袁顺宗彭旭马兵罗高兴吴军
- 关键词：原核表达增生性瘢痕
- 荧光共振能量转移技术检测ITGB4BP与P311间的相互作用被引量：4
- 2007年
- 目的利用激光共聚焦显微镜中的荧光共振能量转移(FRET)技术来验证整合素4结合蛋白(ITGB4BP)和P311间的相互作用。方法分别构建能在哺乳动物细胞中表达ITGB4BP的绿色荧光融合蛋白ITGB4BP-EGFP和表达P311的红色荧光融合蛋白P311-DsRed的重组载体pITGB4BP-EGFP和pP311-DsRed,经酶切与测序鉴定正确后,共转染人胚肾293(HEK293)细胞48h后,采用受体漂白方法(P311-DsRed),检测ITGB4BP和P311间的能量转移率(E)和相互间的作用距离(R)。结果重组载体pITGB4BP-EGFP和pP311-DsRed经双酶切鉴定正确,转染293细胞后经激光共聚焦显微镜观察能分别表达融合蛋白ITGB4BP-EGFP和P311-DsRed,在细胞质和细胞核中存在着共定位,FRET检测结果显示其能量转移率为14%,两个分子间的作用距离为6.3nm。结论成功构建了ITGB4BP-EGFP和P311-DsRed融合蛋白真核表达重组载体,在哺乳动物细胞中进行了表达后,利用FRET技术证实了活体细胞内ITGB4BP和P311间存在着相互作用。
- 袁顺宗谭江琳彭旭马兵曹红卫贺伟峰陈希炜易绍萱胡晓红张小容罗高兴吴军
- 关键词：荧光共振能量转移蛋白相互作用
