国家自然科学基金(0040205401094)
- 作品数：5 被引量：18H指数：2
- 相关作者：周东田林郁陈蕾杨天华耿嘉更多>>
- 相关机构：四川大学华西医院成都中医药大学更多>>
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- 相关领域：医药卫生更多>>
- 大鼠脑微血管内皮细胞的分离、培养及不同纯化方法的比较被引量：15
- 2010年
- 目的对脑微血管内皮细胞分离、培养方法进行探索性研究,并对目前常用的纯化方法进行比较。方法首先采用两次酶消化、两次梯度离心法对大鼠脑血管内皮原代细胞进行分离,然后分别采用免疫磁珠和Thy1.1抗体杀伤法分别进行纯化。结果采用两次酶消化、两次梯度离心法可以成功分离到脑微血管内皮细胞,磁珠纯化法可得到纯度高但是数量较少的细胞,Thy1.1抗体杀伤法可得到纯度及得率均较高的内皮细胞。结论我们所摸索的方法能成功进行纯度较高的大鼠脑微血管内皮细胞原代培养。
- 田林郁李胜富周东
- 关键词：脑微血管内皮细胞原代细胞
- RNA干扰抑制马桑内酯诱导的大鼠星形胶质细胞Mdr1基因的表达
- 2007年
- 目的观察 RNA 干扰对培养的大鼠星形胶质细胞逆转 P-糖蛋白介导的多药耐药现象的影响。方法用短发夹 RNA 表达载体 p-SIREN shuttle 质粒转染马桑内酯诱导表达 P-糖蛋白的星形胶质细胞,荧光定量聚合酶链反应(PCR)测定 Mdrl mRNA 的表达量,免疫细胞化学方法检测 P-糖蛋白表达的变化,流式细胞术检测转染前后细胞罗丹明蓄积外排的变化。结果建立表达 P-糖蛋白的星形胶质细胞模型,有效地将 p-SIREN shuttle 质粒转染该细胞模型。转染后实验组细胞 MdrlmRNA 水平被抑制达67.70%,P-糖蛋白表达明显低于对照组(P<0.01),实验组 P-糖蛋白作用底物罗丹明的细胞外泵出率(23.08%)明显低于对照组(78.35%,P<0.01)。结论 RNA 干扰对马桑内酯诱导的星形胶质细胞 Mdrl 表达有明显抑制作用,并且在很大程度上逆转多药耐药蛋白的耐药作用。
- 杨天华程新望田林郁耿嘉陈蕾周东
- 关键词：P糖蛋白星形细胞内酯类
- 核糖核酸干扰抑制P-糖蛋白在大鼠耐药星形胶质细胞中过度表达
- 2008年
- 目的利用腺病毒载体介导的短发夹RNA（shRNA）抑制大鼠多药耐药基因mdr1b及其编码的P-糖蛋白（Pgp）的表达，探讨其改善癫痫耐药现象的可行性。方法通过同源重组方法构建腺病毒，表达针对mdr1b的shRNA，感染马桑内酯诱导的耐药星形胶质细胞模型。实时定量逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）和Westernblot法分别检测感染5d内细胞mdr1b和Pgp的表达，流式细胞术检测罗丹明泵出率。结果得到6X10^10pfu／ml滴度的重组腺病毒，转染星形胶质细胞后，细胞mdr1b和Pgp表达明显被抑制，干扰率达94％（P〈0．01）。Ad5-EGFP—shRNA1-U6感染组细胞罗丹明泵出率15．8％，明显低于对照组（56．2％，F=127．5，P〈0．05）。结论成功构建针对大鼠mdr1b的RNAi腺病毒载体，并在体外证实其对大鼠mdr1b表达的高效抑制作用，为进一步探索难治性癫痫的基因治疗奠定基础。
- 陈蕾田林郁杨天华周东
- 关键词：腺病毒科小分子干扰P糖蛋白星形细胞
- 马桑内酯体外诱导大鼠星形胶质细胞P-糖蛋白表达被引量：1
- 2008年
- 目的马桑内酯体外诱导耐抗癫痫药物(AED)的星形胶质细胞,并探讨可能的耐药机制。方法培养新生大鼠的星形胶质细胞,传代后向其培养液中按体积1μL,3μL,9μL,15μL滴加马桑内酯,分别在加入药物后第7d,14d,21d,28d用免疫细胞化学和图像分析的方法检测并分析P-糖蛋白的表达。结果从第14d开始至28d,随诱导时间的延长,P-糖蛋白的表达明显增加(P<0.01);在21d,28d组,随马桑内酯剂量的增加,P-糖蛋白的表达无明显增加(P>0.05)。结论马桑内酯体外诱导的大鼠星形胶质细胞对AEDs有耐药性,P-糖蛋白的表达增强可能是其耐药性产生的重要机制。
- 耿嘉周东
- 关键词：星形胶质细胞马桑内酯P-糖蛋白
- 多药耐药基因RNAi重组腺病毒构建被引量：2
- 2007年
- 目的构建抑制多药耐药基因(MDR1)表达的RNAi腺病毒载体,探讨基因治疗改善癫痫多重耐药现象的可行性。方法根据大鼠MDR1基因序列,选择3个19nt的靶序列,设计并合成3对66nt含编码短发夹RNA(shRNA)序列的寡核苷酸,构建pSIREN-shuttle-MDR1重组质粒,测序分析正确后转染通过马桑内酯诱导的已表达多重耐药蛋白的大鼠星形胶质细胞,通过RT-PCR法测定多药耐药蛋白(P-gp)表达量,判断所设计的3条DNA序列对于P-gp表达的抑制作用。选择抑制效率最高的1个重组质粒,将其中的MDR1 shRNA表达结构酶切后插入腺病毒载体pAdeno-X,构建的pAdeno-MDR1经Pac1酶切后与脂质体共转染HEK293细胞进行病毒包装扩增纯化,所得病毒液作酶切电泳及测序分析正确后再转染大鼠星形胶质细胞模型。RT-PCR及免疫组织化学法分别测转染前后星形胶质细胞模型的MDR1及P-gp表达量。结果重组质粒及pAdeno-MDR1病毒经PCR、酶切、测序分析证实构建正确。病毒滴度为6×109pfu/mL。重组腺病毒转染星形胶质细胞后MDR1及P-gp表达量减少,干扰效率接近100%。结论成功构建针对大鼠MDR1基因的RNAi腺病毒载体,并通过体外实验证实其对大鼠MDR1基因的高效抑制作用。为进一步探索难治性癫痫的多药耐药机制和基因治疗奠定了基础。
- 陈蕾冯培民杨天华田林郁程新旺周东
- 关键词：多药耐药基因RNA干扰腺病毒
