浙江省教育厅科研计划项目(Y200805242)
- 作品数：3 被引量：7H指数：2
- 相关作者：许健张婷贾平周云凯边金铎更多>>
- 相关机构：浙江中医药大学浙江省人民医院浙江大学医学院附属邵逸夫医院更多>>
- 发文基金：浙江省教育厅科研计划浙江省科技厅新苗人才计划浙江省中医药管理局科研基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 五种重组人源IL-18突变子表达质粒的构建及其在BxPC-3细胞中的表达被引量：1
- 2012年
- 目的:设计获得5段hIL-18异构体,定向插入pEGFP-C1质粒形成融合基因,转染胰腺癌Bx-PC-3细胞并表达,为进一步研究改建的hIL-18蛋白功能奠定实验基础。方法:设计引物从pGEM-T-hIL-18质粒中PCR扩增得到5段不同的hIL-18片段,分别连接入pEGFP-C1载体构建不同的突变子(Mu0、Mu1、Mu2、Mu3和Mu4),转染原位胰腺癌BxPC-3细胞,以荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达,RT-PCR法检测转染细胞中hIL-18表达水平。结果:(1)五种重组质粒经酶切与测序证实构建成功;(2)BxPC-3细胞转染重组质粒后可观察到绿色荧光蛋白的表达。结论:(1)成功构建了hIL-18五种异构体的绿色荧光蛋白表达载体;(2)改建的hIL-18蛋白可与绿色荧光蛋白在BxPC-3细胞融合表达。
- 孙金权许健沈雯吴晓莉牟一平张婷沃兴德
- 关键词：PEGFP-C1
- 大蒜蒜氨酸酶基因克隆与序列分析及毕赤酵母表达质粒的构建被引量：4
- 2010年
- 根据GenBank登录的蒜氨酸酶序列(S73324)设计上下游引物,利用RT-PCR技术从浙江大蒜鳞茎中扩增蒜氨酸酶基因,获得了长度为1523bp的cDNA序列,提交GenBank(登录号:FJ786257,命名为浙江蒜氨酸酶)。利用生物信息学相关软件对该序列进行同源性比较、进化分析、蛋白质的结构和酶活性中心预测,引用pPICZaC载体构建蒜氨酸酶毕赤酵母真核表达重组质粒。结果表明:浙江蒜氨酸酶与其他葱属植物如大蒜、洋葱、冬葱、火葱和细香葱蒜氨酸酶具有高度同源性,进化关系比较接近,目的基因可以成功构建到毕赤酵母表达载体。浙江蒜氨酸酶三维结构呈树枝状,蛋白质分子的N端含有一个类似表皮生长因子结构域,酶的中心含一个天冬氨酸氨基转移酶超家族结构域;蛋白质结构中Lys-277可能是磷酸吡哆醛的结合位点,Lys-277周围区域可能是酶活性中心部位。重组质粒经鉴定构建正确。
- 吴晓莉许健张婷贾平周云凯
- 关键词：蒜氨酸酶大蒜克隆毕赤酵母
- 大蒜鳞茎蒜氨酸酶基因克隆及其在毕赤酵母中的表达被引量：3
- 2012年
- 目的从大蒜鳞茎中克隆蒜氨酸酶基因,构建蒜氨酸酶真核表达载体,并在毕赤酵母系统中表达,进一步探讨重组蒜氨酸酶的生物学活性。方法利用RT-PCR方法克隆大蒜鳞茎蒜氨酸酶基因,通过pPIczαC载体构建pPIczαC-蒜氨酸酶真核表达质粒,电转化法导入毕赤酵母X-33,筛选阳性克隆,经甲醇诱导后取表达上清进行SDS-PAGE和Western blotting分析。利用丙酮酸法检测重组蒜氨酸酶和提取的天然蒜氨酸酶的活性,Lowry法测2种蒜氨酸酶蛋白质量,通过比活力比较2种酶活性大小。结果从大蒜内克隆出蒜氨酸酶基因,大小为1 500 bp,重组蒜氨酸酶相对分子质量约为5.5×104,存在于毕赤酵母表达上清液中。重组蒜氨酸酶比活力为(82.09±3.89)U/mg,天然蒜氨酸酶比活力为(176.49±5.06)U/mg。结论蒜氨酸酶基因可以在毕赤酵母表达系统中获得表达,重组蒜氨酸酶具有酶活性,但是其活性低于提取的天然蒜氨酸酶。
- 吴晓莉张婷边金铎许健
- 关键词：蒜氨酸酶克隆毕赤酵母RT-PCR
