国家自然科学基金(30600520)
- 作品数：6 被引量：10H指数：2
- 相关作者：黄爱龙张文露余波杨扬吴莹更多>>
- 相关机构：重庆医科大学附属第二医院重庆医科大学北京中医药大学更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- HBVnt453-250负性调节元件作用方式与嗜肝性的研究
- 2009年
- 目的HBVnt453-250序列为乙型肝炎病毒正链的-个新的负性调节元件，探讨其作用方式是否具有方向位点依赖性、启动子选择性以及肝细胞特异性。方法构建含有负性调节元件的质粒pHBV453-250方向和位点置换体（pHBV250-453、plucHBV453-250和plucHBV250-453），分别以荧光素酶（1uciferase）及增强型绿色荧光蛋白（EGFP）作为报告基因，转染HepG2细胞后，通过双荧光素酶体系、荧光定量PCR和Westernblot分析，检测HBVnt453-250序列对目的基因转录及表达的影响；构建启动子置换的质粒pCMV453-250（1uc），转染HepG2细胞后，双荧光素酶检测系统检测荧光素酶表达；将pHBV453—250和pHBV250-453分别转染人宫颈癌细胞（HeLa）和人肺癌细胞（A549），双荧光素酶检测系统检测荧光素酶表达。结果HBVnt453-250序列以正向或反向插入荧光素酶或EGFP基因的5’端或3’端时，均能表现对目的基因转录和表达的下调作用；在CMV启动子引导下，HBVnt453-250序列明显降低了荧光素酶的活性，为对照的36．56％；正反向的HBVnt453-250序列均能在两种非肝源性细胞系中抑制荧光素酶活性。结论HBVnt453-250序列的负性调节作用无方向及位点特异性，无启动子选择性及肝细胞特异性。
- 吴莹张文露余波杨扬黄爱龙
- 关键词：乙型肝炎病毒正链嗜肝性
- 结合通用引物快速简便鉴定阳性克隆的PCR方法被引量：4
- 2008年
- 通用引物与载体多克隆位点两端序列互补,将目的片段构建入载体pGEM-T Easy中,利用载体通用引物M13F和M13R结合片段特异引物进行菌液PCR反应。用PCR产物电泳结果来筛选阳性克隆并鉴定目的片段插入方向,同时能有效对短插入片段重组子进行筛选与鉴定。最终以DNA测序结果来验证,与测序结果一致,显示通用引物PCR方法对阳性克隆的筛选和鉴定优于传统酶切和普通PCR鉴定方法,能够弥补传统方法的不足,且简便快速,可作为筛选和鉴定阳性克隆的有效手段。
- 崔静黄爱龙张文露
- pcDNA3.1载体对内参基因表达影响分析被引量：2
- 2010年
- 目的:研究转染质粒pcDNA3.1对内参基因表达影响差别,为今后在采用pcDNA3.1载体进行表达分析时内参基因的选择提供参考。方法:选用HepG2、HEK293、Hela、A549、QGY共5种细胞转染pcDNA3.1空载体质粒,转染后48h提取细胞总RNA荧光定量PCR法比较内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Glyceraldehyde-3-phosphste dehydrogenase,GAPDH)、肌动蛋白(β-actin)、18sRNA表达水平差异,提取细胞总蛋白,检测GAPDH、β-actin表达水平差异。结果:5种细胞在转染质粒pcDNA3.1后,内参基因转录和蛋白表达均出现不同程度的下降,其中以β-actin下降最为明显,GAPDH及18sRNA在转录水平下降幅度小,且下降程度接近。结论:pcDNA3.1质粒转染造成基因表达非特异性抑制,其中对管家基因β-actin影响较大,因此在应用pcDNA3.1来源载体进行基因功能分析时,不推荐使用β-actin作为内参基因。
- 陈可王增产
- 关键词：PCDNA3.1内参基因转染转录
- 一个新的负性调控元件对乙型肝炎病毒X启动子启动作用的调节被引量：2
- 2007年
- 目的在前期工作已证实HBV基因中的250～453nt为一个新的负性调控元件的基础上，探讨其对HBV X启动子（XP）启动作用的影响。方法构建含250～453nt的HBV X启动子驱动虫荧光素酶表达的质粒pNRE—XP，与表达海肾荧光素酶的质粒RL-TK共转染人肝癌HepG2细胞，用双荧光素酶检测系统检测虫荧光素酶表达，RT—PCR检测虫荧光素酶基因mRNA水平的表达，并与相应对照组进行比较。同时，在含HBV全基因组的质粒LJ196上通过缺失突变的方法除去250～453nt片段，将其与反式提供C、P蛋白的质粒LJ96共转染HepG2细胞，RT—PCR检测X基因mRNA表达，并与对照组比较。结果该负性调控元件存在时，HepG2细胞中虫荧光素酶活性明显低于对照组；逆转录聚合酶链反应中虫荧光素酶基因mRNA表达也低于相应的对照组。在LJ196上突变掉250～453tat后，X基因表达量高于对照组。结论该负性调控元件可下调HBV XP的启动作用，在HBV基因组上缺失掉该片段后XP驱动下的基因表达增加。
- 杨扬吴莹张文露余波黄爱龙
- 关键词：启动子
- 化学发光法检测体外HBV复制被引量：2
- 2009年
- 目的:建立化学发光法检测体外HBV复制水平的方法,研究其灵敏度和稳定性。方法:用HBV DNA重组质粒pCH9转染到人肝癌细胞株HepG2和Huh7中,5d后收集细胞并抽提其HBV复制中间体DNA,转印后以地高辛标记HBV DNA为探针进行杂交,用化学发光法检测杂交结果,同时进行探针灵敏度的检测。结果:转染后HepG2和Huh7细胞提取HBV DNA中检测出较强的复制中间体的信号,分别为松散环状DNA(rcDNA),双链线性DNA(dslDNA),单链DNA(ssDNA),探针检测的灵敏度可达到1pg,接近同位素法检测的灵敏度。整个实验重复3次获得同样结果。结论:成功建立了稳定的化学发光法检测体外HBV复制水平的方法。
- 崔静胡接力张文露王媛媛李毅黄爱龙
- 关键词：HBVDNA化学发光法
- 乙型肝炎病毒正链负性调节元件的亚元件鉴定
- 2008年
- 目的研究乙型肝炎病毒正链负性调节元件（HBVnt453～250）中存在的重要功能亚元件。方法通过构建pHBVnt453～250质粒一系列缺失10 bp的突变体,与内参pRL-TK质粒共转染HepG2细胞,于转染后48 h检测荧光素酶活性并确定亚元件的位置和序列。构建亚元件与pGL3-control载体质粒的重组质粒,与内参pRL-TK质粒共转染HepG2细胞并检测荧光素酶活性,半定量RT-PCR检测荧光素酶的mRNA水平。结果与pHBVnt453～250对照组比较,6个缺失突变体实验组的荧光素酶活性恢复到60%～80%,鉴定出3个功能亚元件。这3个亚元件的重组质粒荧光素酶活性比pGL3-control对照组降低,半定量RT-PCR显示荧光素酶的mRNA水平降低。结论HBVnt453～250序列中含有3个重要功能亚元件,以协同的方式发挥调节抑制作用。
- 余波吴莹杨扬张文露黄爱龙
- 关键词：正链
