国家教育部博士点基金(20104401120008)
- 作品数：3 被引量：4H指数：1
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- 小鼠骨髓来源巨噬细胞的SILAC代谢标记及生物质谱分析被引量：1
- 2012年
- 目的作为模型细胞之一,小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMM)是药理学、药效学研究的重要工具和对象。然而,由于巨噬细胞增殖能力较弱,代谢标记细胞内蛋白一直是巨噬细胞生物学中的一个难题。因此,本研究以SILAC(stable i-sotope labeling with amino acids in cell culture)方法标记BMM。方法小鼠骨髓细胞的分离,以M-CSF诱导6 d并制备BMM,同时,SILAC标记细胞内蛋白;进而,裂解细胞并收集蛋白质,以SDS-PAGE进行初步分离,经胶内酶解成肽段,再通过质谱分析测定,统计得其标记效率。结果小鼠骨髓细胞在分化6 d时点成熟BMM可占细胞总数的0.965。以70 ku条带为研究对象,d 6、8和d 10鉴定到重链赖氨酸标记蛋白数分别为18、12和13个。其中,有8个蛋白在该3个时点中均被检出。统计结果表明3个时点的重链赖氨酸蛋白标记效率分别为(90.62±0.03)%、(90.23±0.03)%和(90.40±0.02)%,达到了SILAC研究的要求。结论该方法解决了BMM的SILAC标记问题,可为以巨噬细胞为研究对象的药理学研究提供有效的研究手段。
- 王通郭嘉慧陈智鹏银兴峰马文心崔毅峙
- 关键词：SILAC质谱蛋白质组
- 脂多糖持续刺激巨噬细胞的免疫学机制初探被引量：1
- 2015年
- 目的:探讨巨噬细胞在脂多糖(LPS)的持续刺激下产生免疫抑制后的表型变化及对T细胞影响的分子机制。方法:蔗糖密度梯度离心法从全血中分离人外周血单个核细胞,结合磁珠细胞分选技术分选出单核细胞,体外诱导单核细胞分化为巨噬细胞,以未处理和IFN-γ处理为对照,对LPS处理48 h的巨噬细胞进行形态学观察、细胞表面分子(HLA-DR、CD14、CCR7、HLA-ABC及CD40)表达的检测和细胞因子(IL-10、IL-12、IL-6及TNF-α)分泌水平的检测。同时将LPS诱导的巨噬细胞与CD3+T细胞进行异体共培养,进一步观察巨噬细胞对T细胞增殖能力的影响。用实时荧光定量PCR验证Toll样受体4(TLR4)信号通路中的非My D88依赖型途径相关分子的表达水平。结果:LPS处理48 h的巨噬细胞,抗原递呈能力(HLA-DR)下降,免疫抑制细胞因子IL-10升高,把LPS诱导的巨噬细胞与异体T细胞共培养6 d,其促进CD8+T细胞增殖的能力较弱。实时荧光定量PCR结果显示LPS持续刺激下巨噬细胞的TRIF、IRF3和CIITA均呈下调状态。结论:持续LPS处理巨噬细胞48 h后,巨噬细胞呈现一种免疫抑制的状态,且其刺激CD8+T细胞增殖的能力减弱,这种状态与非My D88依赖型TLR4信号通路受损有关。
- 龙允麟陈颖余汝媛汪洋
- 关键词：巨噬细胞脂多糖TOLL样受体4
- 携带中国株HIV-1 gp120基因的重组腺病毒的构建及其感染巨噬细胞的形态学研究被引量：2
- 2012年
- 目的:构建携带中国株HIV-1 gp120基因并可感染小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMM)的重组腺病毒。方法:利用AdMax腺病毒构建系统,以双质粒共转染人胚肾转化细胞293Ad5+细胞,完成重组腺病毒载体包装,并进一步扩增和纯化。通过ELISA测定gp120的蛋白产量,以确认目的基因重组与表达成功。以Karber法对病毒进行TCID50滴度测定,利用BMM进行感染复数(MOI)流式细胞术测定,并利用荧光显微镜观察细胞活化形态。结果:成功构建AdMax-HIV-1 gp120(简称Ad-gp120)及其对照病毒(Ad-GFP),其滴度分别为108.3和108.1TCID50/mL。这些病毒可感染BMM,MOI测定结果表明2种重组腺病毒感染BMM和293Ad5+细胞的能力接近,验证了上述TCID50滴度结果。Ad-gp120可在293Ad5+细胞中表达gp120蛋白,并可感染和诱导BMM相关形态改变。结论:成功构建Ad-gp120,其感染可致BMM出现形态发生改变。
- 王通马文心郭嘉慧陈智鹏崔毅峙
- 关键词：重组腺病毒
