国家自然科学基金(30170841)
- 作品数：23 被引量：128H指数：8
- 相关作者：沈继龙汪学龙胡元生刘庆中祖莹更多>>
- 相关机构：安徽医科大学蚌埠医学院安徽医科大学第一附属医院更多>>
- 发文基金：国家自然科学基金安徽省自然科学基金国家高技术研究发展计划更多>>
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- 日本血吸虫信号蛋白14-3-3在虫卵的定位及其免疫诊断价值初探被引量：22
- 2007年
- 目的探讨日本血吸虫信号蛋白14-3-3(Sj14-3-3)在虫卵内的定位和重组Sj14-3-3(rSj14-3-3)的免疫诊断价值。方法从日本血吸虫尾蚴感染42 d的兔肝脏中分离虫卵,用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测Sj14-3-3基因在虫卵期的转录水平;兔肝组织石蜡切片免疫组化染色,观察内源性Sj14-3-3在虫卵内的分布和表达丰度。利用纯化的rSj14-3-3和可溶性虫卵抗原(SEA),采用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)检测急、慢性血吸虫病患者和正常人血清。结果RT-PCR从日本血吸虫成熟虫卵中检出760 bp左右的基因片断;免疫组化显示Sj14-3-3主要分布在虫卵内毛蚴的体壁和两边的侧腺。检测急性、慢性患者和正常人血清抗rSj14-3-3抗原的抗体阳性率分别为91.0%、78.9%、0.0%;上述标本中抗SEA抗体的阳性率分别为97.4%、88.9%和2.5%。结论用ELISA检测抗SEA抗体和rSj14-3-3抗体诊断血吸虫病具有高度的特异性和敏感性,而Sj14-3-3在成熟虫卵阶段高表达,可能是SEA的主要组分,具有实用价值。
- 王志成徐元宏罗飞李敏郑美娟罗庆礼沈继龙
- 关键词：日本血吸虫虫卵免疫诊断
- 重组日本血吸虫信号蛋白14-3-3不同剂量对免疫保护性的影响被引量：6
- 2006年
- 目的观察不同剂量重组日本血吸虫(中国大陆株)信号蛋白14-3-3(rSj14-3-3)的免疫保护性,以探讨最佳的免疫剂量。方法以逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)扩增Sj14-3-3基因,并将其亚克隆入原核表达载体pET28a,然后转化大肠埃希菌进行诱导表达;用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、电洗脱和透析的方法制备纯化的rSj14-3-3蛋白,分5组(第1、2、3组为rSj14-3-3蛋白50μg、100μg和300μg实验组,第4、5组分别为福氏佐剂和生理盐水对照组)免疫BALB／c小鼠并进行攻击感染实验。在尾蚴攻击感染6周后,剖杀小鼠计算各组的减虫率和减卵率。并在试验过程中留取不同时期小鼠血清,检测抗Sj14-3-3特异性IgG抗体。结果成功表达出rSj14- 3-3蛋白,纯化蛋白免疫小鼠行攻击感染后各实验组的减虫率为第1组28．20％、第2组43．10％、第3组40．00％;各组的减卵率分别为(按以上组序)41．80％、57．50％、55．70％。各实验组与对照组比较,差异有统计学意义(减虫率:第1组t=6．8、第2组t=8．7、第3组t=7．3,各组P值均<0．01;减卵率:第1组t=11．23、第2组t=11．54、第3组t=7．99,各组P值均<0．01);各实验组间两两比较,第1组与第2组间(减虫率:X2=8．96,P<0．05;减卵率:X2=15．69,P<0．05)、第1组与第3组间(减虫率:X2=6．52,P<0．05;减卵率:X2=12．52,P<0．05)差异有统计学意义;第2、3两组间差异无统计学意义(减虫率:X2=1．20,P>0．05;减卵率:X2=0．93,P>0．05)。各实验组的抗Sj14-3-3特异性总IgG水平都有显著升高,所测的4个亚型中以IgG1和IgG2a亚型升高为主,IgG2b和IgG3亚型升高不明显。结论重组Sj14-3-3的免疫保护性与免疫剂量有一定关系,以100μg抗原量免疫小鼠获得的保护性最好。
- 刘庆中胡元生沈继龙江宝玲汪学龙
- 关键词：重组蛋白质类抗体生成
- 重组日本血吸虫14-3-3蛋白的纯化和免疫特性分析被引量：8
- 2003年
- 目的 :纯化日本血吸虫信号蛋白质 14 3 3编码基因的原核表达产物 ,分析纯化产物的免疫学特性。方法 :SDS PAGE鉴定重组日本血吸虫 14 3 3(rSj14 3 3)蛋白包涵体 ,超声破碎细胞收集包涵体 ,尿素溶解包涵体 ,NiSO4平衡层析柱 ,亲和层析纯化rSj14 3 3,Western blot鉴定纯化产物的免疫学特性。结果 :rSj14 3 3是以包涵体形式在大肠埃希菌中表达 ,通过亲和层析在 32 .5kDa附近得到单一蛋白条带 ,Western blot证实纯化产物为rSj 14 3 3,且具有与天然Sj 14 3 3相同的抗原表位。结论 :成功纯化了rSj14 3 3蛋白 ,为研究 14 3 3在血吸虫信号转导中的作用奠定了基础。
- 李德发沈继龙祖莹刘庆中
- 关键词：免疫特性日本血吸虫纯化
- 两种血吸虫病疫苗候选分子在原核细胞的融合表达被引量：13
- 2003年
- 目的 在原核细胞中表达 Sj GST和 Sj14- 3- 3的融合蛋白。 方法 RT- PCR法从日本血吸虫成虫总 RNA中扩增出 Sj14- 3- 3基因 ,亚克隆至原核表达载体 p GEX- 4T- 1,并转化 E.coli BL2 1 ,IPTG诱导表达 ,Western- blot鉴定表达产物。 结果 扩增产物约为 76 5 bp,重组质粒经 Bam H 和 Xho 双酶切后可得到一与 PCR产物大小相同的 DNA片段 ,经 IPTG诱导后在 5 5 ku附近出现一新增蛋白条带 ,Western- blot结果显示 ,表达产物可被兔抗鼠 14- 3- 3ε多克隆抗体识别。 结论 在原核细胞融合表达 Sj GST和 Sj14- 3- 3成功。
- 祖莹李德发沈继龙
- 关键词：血吸虫疫苗SJ14-3-3
- rSj14-3-3和rSj14-3-3/SjGST对日本血吸虫虫卵肉芽肿形成的影响被引量：3
- 2003年
- 目的 探讨日本血吸虫信号蛋白 14 - 3- 3基因重组蛋白 (rSj14 - 3- 3)及其与谷胱甘肽S转移酶融合蛋白(rSj14 - 3- 3/SjGST)对宿主肝虫卵肉芽肿形成的影响。 方法 用rSj14 - 3- 3和rSj14 - 3- 3/SjGST免疫雌性BALB/c小鼠 ,末次免疫后 5d ,各组小鼠均感染日本血吸虫尾蚴 4 0± 1条 /鼠 ,6周后 ,剖杀 ,取肝组织计数肝表面虫卵结节密度和肝切片上单个虫卵肉芽肿直径大小。结果 免疫组 (14 - 3- 3组和 14 - 3- 3/GST组 )和对照组肝表面虫卵结节数分别为 6 72±1 14、5 89± 1 0 3和 2 1 0 5± 1 2 6 ,前两者比后者分别减少了 6 8 0 8%和 72 0 2 % ;肝肉芽肿平均直径免疫组为 178 12±32 18μm和 14 8 13± 2 9 6 5 μm ,与对照组 2 75 0 0± 38 2 1μm相比分别减少了 35 2 3%和 4 6 13%。结论 重组抗原rSj14 - 3- 3和rSj14 - 3- 3/SjGST对日本血吸虫具有较好的抗病效果。
- 李德发祖莹沈继龙
- 关键词：日本血吸虫虫卵肉芽肿形成谷胱甘肽S转移酶基因重组蛋白
- 日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3对日本血吸虫病的诊断价值被引量：19
- 2003年
- 目的 探讨纯化的日本血吸虫 (中国大陆株 )重组信号蛋白 14 3 3(rSj14 3 3)诊断血吸虫病的价值。 方法 利用纯化的rSj14 3 3抗原与成虫抗原 ,间接ELISA法检测急、慢性日本血吸虫病患者血清。结果 急、慢性血吸虫患者血清rSj14 3 3抗体检出率为 10 0 %和 92 0 % ,与正常人血清未出现交叉反应 ;抗AWA抗体检出率为 98 0 %和 94 0 % ,与正常人有 7 3%的交叉反应。结论 rSj14 3 3为抗原诊断日本血吸虫病显示出高度的敏感性和特异性 ,具有实用价值。
- 刘庆中沈继龙汪学龙
- 关键词：日本血吸虫病成虫抗原
- 日本血吸虫(中国大陆株)14-3-3信号蛋白的真核表达被引量：1
- 2005年
- 目的 从日本血吸虫成虫 c DNA中扩增出信号蛋白 Sj1 4-3 -3编码基因 ,并亚克隆至真核表达载体 pc DNA3 .1( +) ,旨在制备重组诊断抗原和分子疫苗。方法 提取日本血吸虫成虫总 RNA,分离m RNA,RT-PCR法制备c DNA,并扩增出 Sj1 4-3 -3编码基因 ,通过线性 TA克隆载体 p GEM-T连接 ,亚克隆至真核表达载体 pc DNA3 .1 ( +) ,经转染至 COS-7细胞中表达 ,Western blotting鉴定。结果 RT-PCR产物、p GEM-T-Sj1 4-3 -3及 pc DNA3 .1 ( +) -Sj1 4-3 -3分别经双酶切后均获得一特异性基因片段 ,经 SDS-PAGE及 Western blotting鉴定后的分子量为 2 9k D。结论 真核表达重组质粒 pc DNA3 .1( +) -Sj1 4-3 -3在 COS-7细胞中的表达产物是一分子量为 2 9k D的蛋白 ,并能被抗 Sj1 4-3
- 胡元生沈继龙
- 关键词：日本血吸虫真核表达
- 日本血吸虫重组抗原rSj14-3-3免疫保护作用的初步研究被引量：7
- 2004年
- 目的 初步探讨重组信号蛋白 14 3 3及 14 3 3与GST融合蛋白抗日本血吸虫尾蚴感染和抗血吸虫病的免疫保护作用。 方法 用rSj14 3 3和rSj14 3 3 /SjGST免疫BALB/c小鼠 ,日本血吸虫尾蚴经腹部皮肤攻击感染 ,收集实验组与对照组成虫和虫卵 ,计算减虫率和减卵率 ;间接ELISA法测定实验组与对照组小鼠免疫前、后血清中特异性IgG抗体水平的变化 ;显微镜下测量并比较实验组与对照组肝脏切片上单个虫卵肉芽肿大小 ,观察两种重组抗原对小鼠肝脏肉芽肿形成的影响。 结果 上述两种重组抗原在尾蚴攻击感染后的减虫率分别为 3 1.93 %和 3 4.3 9% ;每克肝组织减卵率分别为 5 3 .2 4%和 60 .0 6% ,每对成虫减卵率分别为 3 3 .3 9%和 40 .48% ;免疫前各组血清IgG抗体A值差异无显著性 ,免疫后实验组血清IgG抗体A值明显高于对照组 ;实验组小鼠肝脏虫卵肉芽肿平均直径比对照组分别下降3 5 .2 3 %和 46.13 %。 结论 信号蛋白 14 3 3在抗感染和抗病免疫中具有保护作用 ,复合多价疫苗的免疫保护作用可能优于单价疫苗。
- 李德发祖莹陈月生沈继龙
- 关键词：免疫保护疫苗
- 日本血吸虫重组信号蛋白14-3-3疫苗免疫保护性的观察被引量：15
- 2003年
- 目的 研究日本血吸虫 (中国大陆株 )重组信号蛋白 14 3 3 (rSj14 3 3 )作为血吸虫病疫苗分子的潜能 ,并探讨rSj14 3 3、rSjGST两种重组蛋白作为疫苗的协同作用及结核杆菌低分子量耐热多肽 (Mtb)激活的γδ T细胞在抗血吸虫病中的作用。 方法 用SDS PAGE、电洗脱和透析的方法制备rSj14 3 3和rSjGST抗原 ,将两种抗原 (分别用福氏佐剂和Mtb为佐剂 )分别免疫BALB/c小鼠后 ,进行尾蚴攻击感染实验。在攻击感染 6wk后 ,剖杀小鼠计算各组的减虫率。 结果 各组的减虫率为rSj14 3 3 +福氏佐剂组 3 2 .2 0 % ,rSj14 3 3 +rSjGST +福氏佐剂组 3 1.10 % ,rSj14 3 3 +Mtb佐剂组 2 7.96% ,rSj14 3 3 +rSjGST +Mtb佐剂组 2 6.0 0 % ,rSjGST +Mtb佐剂组 2 7.10 % ;各组的减卵率分别为 (按以上组序 ) 5 0 .40 %、5 3 .3 0 %、5 1.10 %、5 8.60 %和 5 1.3 0 %。 结论 rSj14 3 3具有一定的抗血吸虫潜能 ,有可能成为抗日本血吸虫疫苗 ,但未见rSj14 3 3和rSjGST的协同作用 ;Mtb激活扩增的γδ T细胞在抗血吸虫免疫中的效果与福氏佐剂产生的免疫作用类似。
- 刘庆中沈继龙
- 关键词：日本血吸虫疫苗免疫保护性
- 弓形虫信号转导蛋白14-3-3基因的克隆与表达被引量：7
- 2003年
- 目的 体外扩增弓形虫RH株信号转导蛋白 14 3 3 (Toxo 14 3 3 )基因编码序列 ,构建原核表达质粒 ,并表达Toxo 14 3 3。 方法 收集、纯化弓形虫RH株速殖子 ,提取RNA ,在设计合成的引物中引入EcoRI和XhoI酶切位点。应用RT PCR扩增Toxo 14 3 3基因片段 ,插入原核表达质粒 pET2 8a中 ,重组子双酶切、PCR和测序鉴定 ,转化大肠杆菌BL2 1并以异丙基 β D 硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达。 结果 从弓形虫RH株RNA中扩增出 80 3bp的Toxo14 3 3基因片段 ,构建重组质粒 pET2 8a/14 3 3 ;IPTG诱导 ,SDS PAGE显示表达产物的大小约 3 0 .7kDa ,Western印迹鉴定为Toxo 14 3 3。 结论 成功地从弓形虫RH株基因组DNA中获取了 14 3 3基因 ,构建了 pET2 8a/Toxo 14 3 3重组质粒 ,并获得高效表达。
- 都建沈继龙汪学龙王维
- 关键词：弓形虫信号转导蛋白克隆
