国家自然科学基金(30271360)
- 作品数：7 被引量：13H指数：2
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- 相关机构：第三军医大学西南医院第三军医大学更多>>
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- 相关领域：医药卫生生物学更多>>
- 单链抗体及其在肿瘤诊疗中的应用被引量：1
- 2009年
- 赵泽文史常旭梁志清
- 关键词：单链抗体肿瘤
- 抗人Endoglin胞外段单链抗体噬菌体表面呈现文库的构建/筛选及鉴定被引量：2
- 2008年
- 目的构建抗人Endoglin胞外段的特异性单链抗体(single chain variable fragment,scFv)噬菌体表面呈现文库。方法用重组人Endoglin(recombinant human Endoglin,rhEndoglin)胞外段蛋白免疫Balb/c小鼠,提取脾脏组织mRNA,经RT-PCR分别扩增出VH(heavy chain variable region)、VL(light chain variable region)基因,经Linker连接成scFv基因,再把scFv基因重组到噬菌粒载体pCANTAB5E,转化到大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13KO7拯救后建成噬菌体呈现文库。用rhEndoglin对文库进行5轮吸附-洗脱-富集panning淘筛,选择ELISA结果最强的克隆提取质粒并测序。结果经过筛选,随机挑取94个克隆进行ELISA检测,37个克隆呈阳性。序列分析表明,该scFv DNA全长738bp。其中VH基因366bp,编码122个氨基酸残基,VL基因327bp,编码109个氨基酸残基,它们之间通过(Gly4Ser)3组成的15肽连接。结论成功构建了抗人Endoglin胞外段scFv噬菌体表面呈现文库,并筛选获得一个能与Endoglin特异结合的重组噬菌体克隆。
- 赵泽文梁志清史常旭常青李军李斌
- 关键词：ENDOGLIN单链抗体
- Endoglin特异性结合短肽筛选及功能分析被引量：2
- 2007年
- 目的:对噬菌体随机12肽库进行筛选,寻求可与Endoglin结合的小分子短肽并测定其亲和常数。方法:经过3轮“吸附-洗脱-扩增”后,随机挑取16个克隆,双夹心ELISA法鉴定其亲和性,测定阳性克隆的DNA序列,竞争抑制实验检测优势克隆的特异性,非竞争法ELISA固相法计算阳性噬菌体融合肽的亲和常数。结果:三轮生物筛选,噬菌体得到有效富集,竞争性ELISA显示6个阳性噬菌体克隆与rhEndoglin有较强的结合活性,测序获得5种多肽序列,优势序列为:AHKHVHHVPVRL,竞争抑制实验显示阳性噬菌体克隆与Endoglin有良好的亲和性,其亲和常数为:(1.431±0.293)×107mol/L。结论:利用噬菌体肽库技术可以获得亲和力较强的Endoglin的结合肽,为今后进一步研究Endoglin在卵巢癌的早期诊断方面的作用奠定基础。
- 毕仙民梁志清侍立峰
- 关键词：ENDOGLIN噬菌体随机肽库结合肽
- 抗rhEndoglin单链抗体的可溶性表达、纯化及活性鉴定被引量：2
- 2009年
- 目的研制抗rhEndoglin-scFv(single chain variable fragment)抗体。方法将具有抗原结合活性的抗rhEndoglin-scFv噬菌体感染大肠杆菌E.coliHB2151,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western Blot鉴定分析。用HiTrap Anti-ETag柱亲和层析纯化scFv抗体,HiTrap Desalting柱行缓冲液更换。用间接ELISA测scFv抗体的亲和常数,用竞争性ELISA和间接免疫荧光检测scFv抗体的抗原结合活性。结果成功诱导表达和纯化抗rhEndoglin-scFv抗体,表达产物主要位于周质腔中,相对分子质量约为2.9×104。测定scFv的亲和常数为(2.14±0.84)×107L/mol,它能与抗rhEndoglin单抗竞争性结合同一抗原表位,且竞争作用随scFv浓度增加而加强。间接免疫荧光实验证实该scFv抗体能识别HUVEC胞膜表达的Endoglin抗原。结论制备的抗rhEndoglin-scFv抗体具有与rhEndoglin和天然Endoglin结合的能力,可望将其用作肿瘤诊断和治疗的靶向载体。
- 赵泽文梁志清史常旭常青陈勇
- 关键词：ENDOGLIN单链抗体免疫活性
- 应用噬菌体肽库筛选Endoglin的结合肽被引量：6
- 2007年
- 目的利用噬菌体12肽库筛选可与Endoglin结合的活性小分子肽。方法以rhEndoglin为靶分子,对噬菌体12肽库进行亲和筛选。经过3轮筛选,随机挑取16个克隆,双夹心ELISA法鉴定其亲和性,测定亲和力高的阳性噬菌体克隆的DNA序列,推断出与噬菌体外壳蛋白融合的氨基酸序列,竞争抑制实验检测优势克隆的特异性。结果竞争性ELISA显示6个噬菌体克隆与rhEndoglin有较强的结合活性,经测序获得5种不同的多肽序列,其中2个克隆的氨基酸序列为:AHKHVHHVPVRL。结论噬菌体随机肽库技术可以获得Endoglin结合肽的蛋白质序列。
- 毕仙民梁志清侍立峰
- 关键词：噬菌体随机肽库ENDOGLIN结合肽
- 抗人Endoglin胞外段单链抗体的可溶性表达和鉴定
- 2008年
- 目的用E.coli HB 2151表达抗人Endoglin胞外段单链可变区片段(single chain variable fragment,scFv),并鉴定其抗原结合活性,为卵巢癌的体内诊断和治疗研究提供靶向载体分子。方法用呈现scFv抗体的重组噬菌体感染E.coli HB 2151进行抗体的可溶性表达,经SDS-PAGE和Western blot鉴定可溶性scFv的表达,竞争性ELISA检测可溶性scFv的抗原结合活性。结果抗人Endoglin胞外段scFv得到了可溶性表达,表达产物主要位于周质腔中,其分子量约为29kD。该周质提取物中scFv能与抗Endoglin单克隆抗体竞争性结合同一抗原表位,且竞争作用随scFv浓度增加而加强。结论用E.coliHB2151成功表达了具有抗原结合活性的抗人Endoglin胞外段scFv,为其应用研究奠定了基础。
- 赵泽文史常旭梁志清常青李军李斌
- 关键词：ENDOGLIN单链抗体噬菌体
- Endoglin结合肽功能性亲和常数的测定被引量：2
- 2007年
- 目的测定人源Endoglin结合肽的亲和常数。方法采用非竞争性ELISA固相法,经戊二醛偶连法包被多肽,确定最佳多肽包被浓度、最佳多肽包被时间及最佳多肽与Endoglin结合反应时间后,得到了结合肽及抗Endoglin IgG与Endoglin的抗原抗体结合反应曲线,计算出结合肽及抗Endoglin IgG与Endoglin的亲和常数。结果结合肽及抗Endog-lin IgG的功能性亲和常数分别为(2.956±0.749)×106mol/L和(7.403±10.76)×108mol/L。结论该结合肽与Endoglin的结合能力较强。
- 毕仙民梁志清侍立峰
- 关键词：酶联免疫吸附测定结合肽抗体亲和力
