河南省科技厅国际合作项目(134300510052)
- 作品数：6 被引量：38H指数：4
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- 芍药FPPS基因的克隆及生物信息学分析被引量：4
- 2016年
- 目的克隆芍药萜类物质生物合成关键酶法呢基焦磷酸合酶(farnesyl pyrophosphate synthase,FPPS)c DNA全长序列并对其进行生物信息学分析。方法根据芍药转录组测序数据,设计一对特异性PCR引物,应用RT-PCR技术扩增出芍药FPPS基因目标条带并克隆至p MD18-T载体上,菌落PCR和质粒PCR鉴定出阳性重组子后进行序列测定及序列同源性搜索、分子系统进化树构建、结构域搜索及3D结构预测等生物信息学分析。结果测序结果表明芍药FPPS基因全长1 315bp,含60 bp的5’-UTR、1 050 bp的CDS和205 bp的3’-UTR,共编码349个氨基酸,Gen Bank登录号为KP708571;Blastn和Blastp分析结果显示芍药FPPS(KP708571)及其编码的蛋白(AKJ26301)在核苷酸水平和氨基酸水平上与多种植物的FPPS基因和FPPS蛋白具同源性;分子进化树分析结果表明芍药FPPS蛋白与其他物种FPPS蛋白的亲缘关系相对较远;预测芍药FPPS蛋白相对分子质量为40 200,等电点为5.33,是一个定位于胞液、不含跨膜结构域、不含信号肽分子的亲水性、稳定蛋白;发现芍药FPPS含有底物结合位点、底物-Mg2+结合位点、催化位点、富含天冬氨酸位点1及富含天冬氨酸位点2共7个保守结构域;3D结构中α-螺旋所占比例高且α-螺旋之间由β-转角(loop)相连接;中央腔(central cavity)由大约10个核心α-螺旋排列而成。结论首次从芍药中克隆了FPPS基因并对其进行了初步的生物信息学分析。
- 徐杰高水平史国安范丙友
- 关键词：芍药基因克隆生物信息学分析
- 芍药‘桃花飞雪’开花衰老期间乙烯代谢生理机制的研究被引量：17
- 2014年
- 以芍药(Paeonia lactiflora Pall.)品种‘桃花飞雪’为试材,测定了不同发育时期花枝以及花瓣的呼吸速率、乙烯释放速率、ACC含量、ACS和ACO活性的变化。结果表明:芍药切花花瓣的乙烯释放速率有明显的跃变峰,整枝花乙烯释放表现为末期上升型。花瓣与花枝呼吸速率均有明显的跃变,花瓣的跃变峰早于整枝花。花瓣的乙烯释放速率及呼吸速率均明显高于花枝,揭示花瓣是花枝产生乙烯的主要器官,花瓣的乙烯释放决定了花枝的开放与衰老进程。花瓣ACS活性与乙烯释放量的变化趋势较为一致,说明ACS是影响乙烯生物合成的限制因子。
- 王哲史国安马雪情范丙友
- 关键词：芍药发育时期乙烯代谢
- 芍药肌动蛋白基因的克隆及表达分析被引量：11
- 2013年
- 目的克隆芍药肌动蛋白(Actin)基因并应用RT-PCR技术分析Actin基因在芍药不同组织中的表达情况。方法根据近缘物种Actin基因的保守序列设计一对PCR扩增引物,以"桃花飞雪"芍药根部总RNA反转录而成的cDNA为模板,采用RT-PCR的方法扩增出芍药Actin cDNA全长并克隆至pMD18-T载体上,阳性克隆经菌落PCR、质粒PCR及酶切鉴定后进行测序。基于测序结果设计特异性PCR引物,应用RT-PCR技术分析Actin基因在芍药根、茎、花、叶不同组织中的表达情况。结果测序结果表明芍药Actin基因全长1 134 bp序列,共编码377个氨基酸,GenBank登录号为JX310002;序列分析表明芍药Actin蛋白中存在3种肌动蛋白特征信号序列,与其他植物肌动蛋白氨基酸同源性达99%;基于同源模建预测的3D结构中含有4个结构域;生物信息学软件预测芍药肌动蛋白的相对分子质量为4.17×104,等电点(pI)为5.31,是一个定位于胞液、不含跨膜域、不含信号肽分子的亲水性、稳定蛋白;半定量RT-PCR技术分析表明Actin基因在芍药根、茎、叶、花组织中的表达量保持恒定。结论首次从芍药中克隆了Actin基因,半定量RT-PCR表达分析结果表明Actin基因适合作为芍药功能基因表达分析的内标基因,为有效利用该基因奠定了基础。
- 范丙友李芳张文婷史国安
- 关键词：芍药肌动蛋白基因克隆RT-PCR
- 采收期对芍药切花保鲜效果的影响被引量：5
- 2013年
- 适期采收是芍药切花采后保鲜的关键技术。为确定芍药切花的最适采收期,以西施面芍药为材料,研究了采收期对芍药切花的瓶插寿命、开放寿命、切花花径、鲜质量损失率的影响。结果表明,Ⅱ级(松瓣期)采收的芍药切花瓶插寿命及开放寿命均优于Ⅲ(转色期)和Ⅳ级(暄蕾期)花,尽管切花花径略小于Ⅲ和Ⅳ级花,但其观赏价值并未明显降低;保鲜液(2%蔗糖+200mg/L 8-羟基喹啉+1mol/L硫代硫酸银)对于增大切花花径、延缓并减少切花鲜质量损失具有一定促进作用。
- 高水平魏春梅王焰吕明范丙友
- 关键词：芍药采收期切花保鲜效果
- 芍药肌动蛋白基因组DNA的克隆及分析被引量：2
- 2014年
- 目的克隆芍药Paeonia lactiflora肌动蛋白(Actin)基因组DNA序列并解析基因结构,分析Actin基因在芍药不同组织中的表达情况。方法根据本课题组报道的芍药Actin基因cDNA序列(JX310002)设计特异性引物,以芍药栽培品种"桃花飞雪"总DNA为模板,用KOD-Plus高保真DNA聚合酶扩增芍药Actin基因组基因,克隆PCR产物并进行测序。应用生物信息学软件预测芍药Actin基因的外显子及内含子,基于Blastn程序分析芍药Actin基因在核苷酸水平上的同源性,应用MEGA5.0软件构建分子系统进化树;设计跨越内含子的半定量RT-PCR扩增引物,分析芍药Actin基因在芍药根、茎、叶、花中的表达情况。结果测序结果表明芍药Actin基因组DNA序列全长1 405 bp,含4个外显子和3个内含子,3个内含子中共6个剪接位点均遵循高等真核生物5’端供位GU与3’端受位AG模式;共编码377个氨基酸,GenBank登录号为KF363830。设计了一对半定量RT-PCR扩增引物,其中上游引物跨越了芍药Actin基因的第1个内含子,可有效防止由DNA污染而造成RT-PCR扩增的假阳性;半定量RT-PCR分析结果表明Actin基因在芍药根、茎、叶、花等不同组织中的表达量保持恒定。结论首次克隆了芍药Actin基因组DNA序列并明确了其基因结构,半定量RT-PCR分析结果表明Actin基因可以作为芍药功能基因表达分析的内标基因。
- 范丙友张文婷徐杰骞光耀高水平郭丽丽侯小改
- 关键词：芍药肌动蛋白基因组DNA克隆基因结构
- 芍药Actin基因在大肠杆菌中的高效表达被引量：2
- 2015年
- 目的构建芍药Paeonia lactiflora Actin（Pl Actin）基因原核表达载体,优化Pl Actin基因在大肠杆菌中的高效表达体系。方法基于Pl Actin基因c DNA序列及原核表达载体p ET-32a（＋）多克隆位点序列,设计一对5’末端分别插入Bam H I和Hind III酶切位点的特异性PCR引物,基于RT-PCR技术亚克隆Pl Actin基因;用Bam H I和Hind III双酶切重组质粒p MD18-T-Pl Actin和原核表达载体p ET-32a（＋）,胶回收纯化目的基因和空载体,连接、转化后应用菌落PCR、质粒PCR和双酶切鉴定出重组子p ET-32a（＋）-Pl Actin,转化BL21（DE3）菌株获得基因表达工程菌;分别设置诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）浓度梯度、诱导的菌体起始密度梯度及表达时间梯度,诱导Pl Actin基因在大肠杆菌中表达,SDS-PAGE电泳、考马斯亮蓝R250染色后制备干胶并比较重组Actin蛋白的表达量。结果亚克隆测序结果表明Pl Actin与目的序列完全一致,且其编码区序列（CDS）上下游成功插入了Bam H I和Hind III酶切位点;成功构建了芍药原核表达载体p ET-32a（＋）-Pl Actin;诱导剂IPTG的最佳浓度为0.1 mmol/L,诱导的菌体起始密度（A600）为0.4~0.6,最佳表达时间为4 h。结论构建了Pl Actin基因原核表达载体p ET-32a（＋）-Pl Actin,建立了Pl Actin基因在大肠杆菌中的高效表达体系。
- 徐杰高水平张文婷史国安范丙友
- 关键词：芍药ACTIN大肠杆菌SDS-PAGE电泳
