山东省自然科学基金(ZR2010HM090)
- 作品数：9 被引量：14H指数：3
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- hBMP2/hVEGF165双基因腺病毒修饰BMSCs复合n-HA/PA66修复骨缺损影像学观察被引量：4
- 2015年
- [目的]探讨携带h BMP2/h VEGF165双基因重组腺病毒共修饰BMSCs复合多孔n-HA/PA66修复兔桡骨大段骨缺损在不同时相点影像学动态变化和临床影像评估的可靠性。[方法]选取40只成年新西兰大白兔,雄性,体重2.8-3.1 kg,采用完全随机法分为2大组,每组20只,手术制作15 mm双侧桡骨中段骨缺损模型。A1组：左侧骨缺损处不植入任何材料为空白对照组;A2组：右侧骨缺损处植入h BMP2/BMSCs/n-HA/PA 66人工骨材料;B1组：左侧骨缺损处植入BMSCs/n-HA/PA66人工骨材料;B2组：右侧骨缺损处植入h BMP2/h VEGF165/BMSCs/n-HA/PA 66人工骨材料。分别于术后2、4、8、12周进行X线、CT三维重建观察和甲苯胺蓝组织染色观察。[结果]B2组各个时期Lane-Sandhu法X线射线评分均高于其他各组,差异有统计学意义（P〈0.05）,A2组优于B1组（P〈0.05）,A1组最差（P〈0.05）;且CT三维重建骨形成量和组织染色效果均优于同期其他各组。[结论]h BMP2/h VEGF165双基因重组腺病毒共修饰BMSCs复合多孔n-HA/PA66人工骨材料治疗兔大段骨缺损,影像学观察,直观、形象地显示了其持久、稳定、高效的骨修复作用,为基因治疗复合人工骨材料修复骨缺损提供了良好的实验依据。
- 管大凡陈月芹刘洪美张聪李庆伟陈国武梁啸孟纯阳
- 关键词：骨形态发生蛋白2血管内皮生长因子165
- 临床剂量浓度透明质酸对骨髓间充质干细胞旁分泌及过表达VEGF165作用影响的实验研究被引量：1
- 2014年
- [目的]观察临床剂量浓度透明质酸干预骨髓间充质干细胞（bone maltow mesenchymal stem cells，BMSCs）后对其生长、旁分泌和过表达VEGFl65蛋白水平的影响。[方法]将细胞生长曲线测定与细胞分泌VEGFl65水平测定均分为4组：A组（DMEM／F12），B组（HA），C组（HA＋Ad—VEGF165），D组（Ad—VEGF165），每组6个复孔。采用密度梯度离心法分离BMSCs和流式细胞术并进行细胞表型鉴定。取第3代BMSCs做为实验对象，Ad—VEGF165转染BMSCs后和或与HA复合培养6h，然后观察细胞形态、生长曲线、VEGFl65分泌水平变化。[结果]各组细胞形态未见明显差异和变化；C组与D组细胞生长曲线OD值在第1～5d均高于A组与B组；A组（34．524-2．13）与B组（34．90±1．78）均有较低水平的旁分泌VEGF65蛋白，而Ad—VEGF165转然后的C组（1487．29±36．08）与D组（1474．48±49．13）VEGF165分泌水平明显增高，但两组差异无统计学意义，而与A组、B组相比较差异均有统计学意义。[结论]治疗剂量透明质酸钠对BMSCs生长、增殖、旁分泌及过表达VEGF165蛋白无明显影响。
- 张聪刘洪美李庆伟陈国武梁啸孟纯阳
- 关键词：透明质酸骨髓间充质干细胞血管内皮生长因子165
- VEGF165过表达对BMP2成骨细胞分化影响的实验研究被引量：2
- 2015年
- [目的]探讨腺病毒转染血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF165)对骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein 2,BMP2)促成骨细胞分化的抑制性作用研究。[方法]采用密度梯度离心法分离兔骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),取第3代BMSCs进行细胞表型鉴定并作为细胞实验对象,使用Ad-BMP2和Ad-BMP2-VEGF165载体体外转染BMSCs,倒置荧光显微镜下观察GFP表达变化;同时ELISA和Western blot检测BMP2和VEGF165蛋白的表达。然后,应用成骨细胞诱导培养液定向诱导BMSCs向成骨细胞分化。实验分3组:Ad-BMP2-VEGF165转染BMSCs组(Ad-BMP2-VEGF165组),AdBMP2转染BMSCs组(Ad-BMP2组),BMSCs组(对照组)。分别在成骨细胞诱导培养后7、14、21 d,通过Real-time PCR分析ALP和OC mRNA相对表达水平和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性测定、骨钙素(Osteocalcin,OC)免疫组化染色来评价各组BMSCs成骨分化潜能的影响。[结果]第3代细胞表面高表达CD29(99.82%)、CD44(94.14%),低表达CD14(3.11%)、CD34(0.34%);腺病毒转染后第5 h BMP2和h VEGF165蛋白水平表达最高;成骨细胞诱导培养14和21 d后,Ad-BMP2组成骨相关基因表达、OC免疫组化和ALP活性表达最高,结果与其他两组相比较差异具有统计学意义(P<0.05);而对照组表达最弱,与Ad-BMP2-VEGF165组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。[结论]腺病毒载体Ad-BMP2与Ad-BMP2-VEGF165转染BMSCs后,均具有明显促进BMSCs体外诱导成骨细胞分化潜能,但Ad-BMP2诱导作用更为显著,同时说明VEGF165可能对BMSCs成骨细胞分化起抑制作用。
- 张聪刘洪美李庆伟陈国武梁啸孟纯阳
- 关键词：骨形态发生蛋白2成骨细胞
- 腺病毒载体介导人BMP-2与VEGF-165对骨髓间充质干细胞形态特征及增殖能力影响的实验研究被引量：1
- 2015年
- 目的探讨携带骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP-2)与血管内皮生长因子165(vascular endothelial growth factor 165,VEGF-165)双基因的腺病毒载体转染骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)后对细胞形态特征及增殖能力的影响。方法选取4只新西兰大白兔抽取骨髓液,分离鉴定获得第3代BMSCs做为实验对象,实验分成4组:Ad-BMP-2-VEGF-165转染组(A组);Ad-BMP-2转染组(B组);AdVEGF-165转染组(C组);BMSCs对照组(D组),每组6个复孔,连测3次。首先,将腺病毒载体转染BMSCs,获得最佳感染复数(multiplicity of infection,MOI);其次,转染后1-3d观察转染各组细胞与D组形态和贴壁状况差异变化;再次,ELISA法检测转染各组目的蛋白表达量与D组的差异;最后,MTT法测定1-7d各组细胞增殖曲线,并进行组间比较。结果 BMSCs分离鉴定成功,第3代细胞高表达CD29(99.82%),CD44(94.14%)抗原。腺病毒转染组最佳MOI值分别为A组MOI=80,B组MOI=80,C组MOI=100。腺病毒转染后各组细胞形态和贴壁特性未见明显改变,边界清晰,细胞呈梭形,细胞核较大呈圆形或椭圆形,生长旺盛。转染组细胞高表达目的蛋白,在第5d目的蛋白浓度到高峰,A组BMP-2浓度为1525.47±58.16pg/ml,B组为1506.48±92.65pg/ml;A组VEGF-165浓度为1732.14±126.25pg/ml,C组为1733.59±127.07pg/ml,转染组在不同时间点的目的蛋白表达量与D组差异均具有统计学意义(P<0.05)。MTT法显示第1d、第2dBMSCs未见明显增长,第3d开始呈指数增长,第5d达高峰;第3d,A组、B组吸光度(optical density,OD)值分别为0.113±0.004、0.112±0.003,均高于C组、D组(P<0.05);第4d,A、B、C各组OD值分别为0.113±0.004、0.110±0.003、0.105±0.001,均高于D组0.102±0.004,且差异有统计学意义(P<0.05)。结论 BMP-2与VEGF-165对BMSCs形态和贴壁性无明显影响,但是均可以促进BMSCs增殖,且两者对细胞的增殖无明显叠加作用。
- 张聪刘洪美李庆伟陈国武梁啸孟纯阳
- 关键词：骨形态发生蛋白2血管内皮生长因子165腺病毒载体
- 氧预处理的BMSCs联合支架材料修复骨缺损的研究进展
- 2013年
- 骨髓间充质干细胞在一定的条件下可以分化为具有特定功能的细胞系,作为种子细胞参与骨缺损的修复,显示了良好的应用前景。氧预处理是种子细胞在种植到支架材料前,为改善细胞生存和适应能力所采取的措施,旨在减少或防止种子细胞丢失。本文就经过氧预处理的骨髓间充质干细胞联合支架材料修复骨缺损的研究进展进行综述。
- 李庆伟张聪孟纯阳
- 关键词：骨缺损预处理高压氧
- hBMP2与hVEGF165双基因腺病毒载体转染BMSCs复合n-HA/PA66组织工程骨构建及检测被引量：3
- 2015年
- [目的]探讨腺病毒介导共表达人骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)和血管内皮生长因子165(vascular endothelia growth factor 165,VEGF165)载体转染兔骨髓间充质干细胞复合纳米羟基磷灰石/聚酰胺66(nano-hydroxyapatite/polyamide66,n-HA/PA66)体外构建组织工程骨的可行性。[方法]采用密度梯度离心法分离骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),取第3代BMSCs进行细胞表型鉴定;第3代BMSCs作为细胞实验对象,实验共分2组:Ad-BMP2-VEGF165为实验组和Ad-GFP为对照组;首先用不同感染复数感染BMSCs,并进行ELISA和Western blot检测细胞h BMP2和h VEGF165的表达;其次将感染后的细胞接种到n-HA/PA66生物材料上,7 d后扫描电镜观察细胞贴附、生长状况;同时,7 d后消化收集贴附n-HA/PA66上的细胞,Western blot检测贴附生物材料细胞中骨钙素(osteocalcin,OC)和骨桥蛋白(osteopontin,OPN)的表达,以及3 d和7 d后的碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)活性测定。[结果]第3代细胞表面高表达CD29(99.82%)和CD44(94.14%),低表达CD14(3.11%)和CD34(0.34%);腺病毒感染后h BMP2和h VEGF165蛋白水平高表达;扫描电镜见感染细胞分布均匀,生长状态良好。实验组与对照组相比,复合n-HA/PA66后Western Blot检测显示OC和OPN表达和ALP活性均较高,两组差异均有统计学意义(P<0.05)。[结论]Ad-BMP2-VEGF165双基因腺病毒感染BMSCs后目的蛋白较高量表达,同时感染后BMSCs可以在n-HA/PA66进行良好的黏附、生长、增殖、矿化,Ad-BMP2-VEGF165双基因表达组织工程骨构建成功。
- 张聪刘洪美李庆伟陈国武梁啸孟纯阳
- 关键词：骨形态发生蛋白2血管内皮生长因子165生物支架
- 骨形态发生蛋白2／血管内皮生长因子165转染骨髓间充质干细胞复合多孔纳米羟基磷灰石／聚酰胺66修复兔桡骨缺损被引量：3
- 2015年
- 目的评估骨形态发生蛋白2／血管内皮生长因子165（hBMP2／hvEGF165）双基因腺病毒转染骨髓间充质干细胞（BMSCs）复合多孔纳米羟基磷灰石／聚酰胺66（n—HA／PA66）对骨缺损的修复作用。方法选取60只成年雄性新西兰大白兔，制作15mm双侧桡骨中段骨缺损模型。按完全随机法分为3组，各组20只，根据双侧桡骨制作骨缺损模型，各大组分2小组，共6组。A1组：左桡骨缺损处不植入任何材料为空白对照组；A2组：右桡骨缺损处单纯植入n—HA／PA66人工骨材料；B1组：左桡骨缺损处植入hVEGF165／BMscs／n—HA／PA66人工骨材料；B2组：右桡骨缺损处植入BMP2／BMSCs／n—HA／PA66人工骨材料；C1组：左桡骨缺损处植入BMSCs／n—HA／PA66人工骨材料；C2组：右桡骨缺损处植入hBMP2／hVEGF165／BMscs／n—HA／PA66人工骨材料。分别于2，4，8，12周行x线片、HE和Masson染色观察桡骨缺损修复情况。结果c2组术后8周x线片、HE和Masson染色显示移植部位有大量软骨形成，且在边缘有大量骨组织生成，术后12周可见组织材料被外层骨组织包裹，骨缺损修复效果优于其他组（P〈0．05）；且术后各时相点C2组血管数目均优于其他组（P〈0．05），B1组各时相点血管数均多于B2组（P〈0．05），且两组明显多于A2、c1组（P〈0．05）；A2与c1组间差异无统计学意义（P〉0．05）。结论hBMP2／hVEGF165双基因转染BMSCs复合多孔n—HA／PA66具有明显提高修复兔桡骨干缺损的作用。
- 管大凡刘洪美张聪李庆伟陈国武梁啸孟纯阳
- 关键词：骨形态发生蛋白质类血管内皮生长因子类骨缺损
- 骨髓间充质干细胞在骨缺损修复中的研究及应用进展被引量：1
- 2013年
- 各种因素造成的骨缺损是临床常见疾病,因骨结构改变、成骨细胞的缺乏、生长因子和新生血管的不足等原因致使该疾病治疗令临床医师们困惑难待。骨髓间充质干细胞具有低免疫源性、易获得性、分化成骨性等优点,尤其是近10年来骨修复支架材料的研发和基因工程的发展使得其更加受到临床医师的青睐。虽然部分已应用于临床,但多数还处于实验研究阶段,许多问题还有待于进一步探索和研究。
- 张聪孟纯阳
- 关键词：骨髓间充质干细胞骨缺损组织工程骨
- 幼兔髂骨穿刺抽取骨髓间充质干细胞分离培养鉴定:注意的细节与技术被引量：1
- 2014年
- 背景:骨髓间充质干细胞被认为是构建组织工程骨修复骨与软骨缺损中较为常用的种子细胞,在其基本操作过程中注意常见问题并及时避免,对后期细胞学及组织工程学实验很有意义。目的:通过作者实验操作过程中所遇问题的总结和分析,为初学者和科研人员提供可靠的骨髓间充质干细胞分离培养鉴定方法,减少操作过程中的人为失误和易犯问题。方法:取16只幼年新西兰大白兔作为实验对象,进行髂骨穿刺抽取骨髓液。采用密度梯度离心法联合贴壁培养法体外筛选纯化细胞,并且通过倒置相差显微镜观察其形态学特点、生长曲线和流式细胞术鉴定骨髓间充质干细胞表型。结果与结论:实验过程中前5只兔骨髓抽吸、骨髓间充质干细胞分离过程中遇到不同的问题和困难,经认真总结和分析,后11只兔骨髓抽吸、骨髓间充质干细胞分离均获成功,在细胞培养过程中未发现细菌污染和细胞老化,第3代骨髓间充质干细胞高表达CD29、CD44抗原,而CD14、CD34抗原低表达,MTT测细胞生长曲线显示P3和P5增殖活性较高。尽管骨髓间充质干细胞分离培养鉴定技术已较为成熟,但是如果操作过程中不注意细节问题,也将会导致实验困难重重或失败。严格执行常规操作步骤可以得到纯度较高的骨髓间充质干细胞,提高成功率,为后续相关细胞实验和动物实验做好准备。
- 张聪刘洪美李庆伟陈国武梁啸孟纯阳
- 关键词：干细胞骨髓干细胞骨髓间充质干细胞种子细胞表型鉴定
