国家科技重大专项(2009ZX1004-302)
- 作品数：10 被引量：35H指数：4
- 相关作者：胡薇徐斌冯正卢艳王小宁更多>>
- 相关机构：中国疾病预防控制中心华东理工大学复旦大学更多>>
- 发文基金：国家科技重大专项国家高技术研究发展计划国际科技合作与交流专项项目更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 日本血吸虫含EF-手型结构域钙结合蛋白的克隆表达与免疫诊断分析被引量：2
- 2012年
- 目的克隆和表达日本血吸虫(Schistosoma japonicum)含EF-手型(EF-hand)结构域钙结合蛋白(SjEFCAB)的编码基因,纯化表达产物,鉴定重组蛋白的反应原性,初步评价其用于日本血吸虫病诊断的价值。方法以日本血吸虫虫卵cDNA文库中免疫筛选所获阳性克隆删除环化后的pBluescript-SjEFCAB质粒为模板,扩增SjEFCAB基因,将目的基因片段与原核表达载体pGEX-4T-1连接构建重组质粒pGEX-4T-1-SjEFCAB,转化至大肠埃希菌(Escherichia coli)BL21,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)标签亲和层析法纯化表达产物,蛋白质印迹(Western blotting)分析其反应原性。以SjEFCAB为包被抗原,采用间接ELISA方法检测日本血吸虫病(78份)、华支睾吸虫病(5份)、猪囊尾蚴病(10份)、卫氏并殖吸虫病(6份)和旋毛虫病(9份)患者血清,以及健康人血清(50份),评价该重组蛋白的免疫学诊断效果。结果构建了重组质粒pGEX-4T-1-SjEFCAB,并在E.coli BL21中高效表达,经亲和层析纯化获得可溶性重组蛋白SjEFCAB。Western blotting分析结果显示,重组蛋白SjEFCAB能被感染兔血清和血吸虫病患者血清所识别,在相对分子质量(Mr)约为8 200处出现条带。间接ELISA检测日本血吸虫病患者血清的敏感性为82.1%(64/78),特异性为95.0%(76/80)。与华支睾吸虫病患者、猪囊尾蚴病患者和旋毛虫病患者血清的交叉反应分别为1/5、1/10和1/9,与卫氏并殖吸虫病患者血清无交叉反应(0/6)。结论日本血吸虫SjEFCAB重组抗原具有较高的免疫学诊断价值。
- 卢艳徐斌鞠川莫筱瑾陈绅波冯正王小宁胡薇徐斌
- 关键词：日本血吸虫免疫诊断
- 日本血吸虫金属蛋白酶基因的克隆和表达及其对小鼠的免疫保护性研究被引量：2
- 2011年
- 目的克隆和表达日本血吸虫金属蛋白酶(metalloprotease)编码基因并纯化表达产物,观察其在成虫体内定位及在小鼠的免疫试验。方法根据表达序列标签(EST)测序的结果设计引物,从含有金属蛋白酶基因的日本血吸虫cDNA克隆(SJM2CFB04,简称SjB04)中扩增得到该编码基因片段,亚克隆至原核表达载体pET28a中表达,应用组氨酸标签亲和层析法纯化表达产物,蛋白质印迹(Western blotting)分析其免疫原性。应用间接免疫荧光法,观察金属蛋白酶在血吸虫成虫体内的分布。将18只C57BC/6小鼠随机分成两组,实验组用SjB04重组蛋白(25μg/只)免疫小鼠,共3次,每次间隔2周;对照组用佐剂免疫(50μl/只)。末次免疫后2周,每鼠腹部感染40±2条日本血吸虫尾蚴,攻击后第37天起连续收集6 d小鼠粪便,计算每克粪虫卵数和减卵率;第42天剖杀小鼠,门静脉灌注收集成虫并计算减虫率。结果获得了SjB04基因(ORF 528 bp)的编码序列,构建了原核表达载体,并在大肠埃希菌中表达,经组氨酸标签亲和层析法获得纯化重组蛋白SjB04。免疫荧光法检测结果显示,SjB04主要定位于日本血吸虫成虫的肠管表皮。Western blotting分析结果显示,该纯化重组蛋白SjB04能被感染兔血清和免疫兔血清识别,在相对分子质量(Mr)29 800处出现一清晰条带。用该纯化蛋白免疫C57BC/6小鼠后,减虫率为27.1%,粪减卵率为57.8%。结论克隆获得的日本血吸虫SjB04重组蛋白主要定位于日本血吸虫成虫的肠管表皮,该蛋白可明显减少感染日本血吸虫的C57BC/6小鼠的粪卵排出量。
- 徐斌鞠川卢艳莫筱谨冯正许学年胡薇
- 关键词：日本血吸虫金属蛋白酶免疫保护力
- 中国大陆福寿螺种群遗传学研究被引量：10
- 2011年
- 目的通过遗传标记分析中国大陆福寿螺种群结构特点,为研究其侵入途径和扩散模式提供基础。方法利用CO I基因扩增引物对中国大陆60个采集点的581个福寿螺标本进行遗传学分析。利用DnaSP 5.10.01进行单倍型多样性和核酸多样性分析,并通过Network 4.2.0.1进行单倍型网络分析。综合GenBank上可利用的福寿螺单倍型和本研究获得的单倍型进行进化关系分析,了解中国大陆福寿螺的进化地位。结果共获得556条有效序列,分属25个单倍型,其中6个单倍型频率较高,占整个样本的96.0%。进化分析表明我国存在Pom cea canaliculata和P.insula-rum2个种。P.insularum单倍型与国外报告类型存在较大差异。结论中国大陆福寿螺种群结构复杂,可能有多种来源和扩散模式。
- 吕山张仪刘和香胡铃柳伟刘琴李石柱胡薇Jurg Utzinger周晓农
- 关键词：福寿螺种群遗传学COI基因
- 金诺芬抗日本血吸虫活性机制及其细胞毒性的探讨被引量：1
- 2012年
- 目的探讨金诺芬对日本血吸虫（Schistosoma japonicum）童虫和成虫作用效果的差异及其作用靶点，测定金诺芬对宿主细胞的毒性。方法用二硫苏糖醇（DTI？）／胰岛素还原法体外测定金诺芬对重组sjTrx-酶活性的影响。用日本血吸虫尾蚴感染4～6周龄雌性昆明鼠（童虫组10只小鼠，600-800条／只；成虫组10只小鼠，80-100条／只）．灌注法收集童虫（15d）和成虫（35d）。虫体经无菌生理盐水充分洗涤后，转移至预先添加培养基的12孔板中．分别加入金诺芬和吡喹酮至其终浓度为1、5和10μg／ml，显微镜下观察化合物处理2、24、48和72h后虫体的形态改变和死亡情况。CCK．8试剂盒测定金诺芬（5和10Ixg／m1）对3种人源宿主细胞（HepG2、293T和Hela）的毒性。结果10μg／ml金诺芬作用下，40min内重组Si协．1还原胰岛素的总量减少54．5％。5μg／ml金诺芬体外作用24h后．成虫死亡率达75％，而童虫未见死亡；10μg／ml金诺芬作用72h后，童虫和成虫均全部死亡，但童虫死亡时间较成虫延迟。金诺芬和吡喹酮作用后，光镜下观察．虫体均出现颜色变灰暗、挛缩和卷曲等现象：电镜下可见虫体表被膜结构严重破坏。细胞毒性测试结果显示，5μg／ml金诺芬可使细胞相对活力降低85％以上，而10μg／ml时细胞几乎全部死亡。结论sjTrx-是金诺芬作用靶点之一。金诺芬具有较强的细胞毒性作用，对日本血吸虫成虫和童虫的作用效果存在差异．对成虫的作用效果更显著。
- 刘建胡薇徐斌王吉鹏王树奇王小宁
- 关键词：金诺芬日本血吸虫靶点细胞毒性
- 日本血吸虫两种酪氨酸酶的克隆、表达和转录特异性分析被引量：1
- 2014年
- 目的克隆、表达日本血吸虫2种酪氨酸酶SjTYR1和SjTYR2的全长基因．并研究这2种基因在日本血吸虫不同性别和不同发育阶段的转录特异性。方法设计特异性引物，从日本血吸虫成虫cDNA文库中扩增出SjTYR1和SjTYR2的全长片段，并克隆人原核表达载体pSJ2，验证正确的重组质粒转化大肠埃希菌（E．coli）Rosetta Gami细胞，使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达，并用组氨酸标签对表达产物进行亲和层析纯化。将纯化后获得的重组蛋白SjTYR1和SjTYR2分别免疫新西兰白兔制备免疫兔血清。分别以重组蛋白免疫兔血清和日本血吸虫感染兔血清为一抗，用蛋白质印迹（Western blotting）分析重组蛋白的免疫原性和免疫反应性；以重组蛋白免疫兔血清为一抗．用Westernblotting观察其与日本血吸虫虫体蛋白的反应情况。制备感染后14、16、18、20、22、24、26和28d雌虫和雄虫的总RNA，利用RT-PCR分析SjTYR1和SjTYR2基因在日本血吸虫不同性别及不同发育时间的转录水平的差异。结果构建了重组原核表达载体SjTYR11/pSJ2和SjTYR2／pSJ2，诱导后获得包涵体形式表达的重组蛋白，相对分子质量（尬）分别为55000和56800，与预测的融合蛋白相对分子质量相符。纯化后的重组蛋白SjTYR1可被日本血吸虫感染兔血清识别，而SjTYR2则不能。rSjTYR1免疫兔血清与虫体蛋白反应后，可见一条约M100000的条带，rSjTYR2免疫兔血清不与虫体蛋白反应。在雄虫体内，2种酪氨酸酶均不转录；在雌虫体内，2种酪氨酸酶在感染后24d内不转录，自24d开始出现激增，之后逐渐提高，感染后28d达到相对最大值。结论构建了SjTYR1和SjTYR2的重组质粒并表达，2种重组蛋白均具有免疫原性和免疫反应性。SjTYR1和SjTYR2在血吸虫雌虫中特异表达，且在感染终宿主后24-28d转录水平升高。
- 李娜娜王吉鹏杜晓峰胡薇
- 关键词：日本血吸虫酪氨酸酶克隆
- 日本血吸虫硫氧还蛋白-1的克隆、表达和功能分析被引量：4
- 2012年
- 目的克隆、表达日本血吸虫硫氧还蛋白-1(SjTrx-1)编码基因,测定重组SjTrx-1蛋白的酶催化活性,分析SjTrx-1基因在血吸虫不同发育阶段的转录本差异,观察其在日本血吸虫成虫体内的组织分布情况。方法从日本血吸虫cDNA文库中挑选SjTrx-1的基因序列,应用PCR技术对目的片段进行体外扩增,并克隆入原核表达载体pET28a,重组质粒转化E.coli BL21(DE3)细胞,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,组氨酸标签亲和层析法纯化表达产物,二硫苏糖醇(DTT)/胰岛素还原法测定重组SjTrx-1蛋白的酶催化活性。纯化的重组SjTrx-1蛋白免疫新西兰白兔,以制备的免疫兔血清作为抗体,应用免疫荧光定位技术检测SjTrx-1在日本血吸虫成虫体内的分布情况。制备日本血吸虫各虫期的总RNA样品,利用RT-PCR方法扩增目的片段,分析SjTrx-1基因在各发育阶段的转录本丰度。结果构建了重组表达载体SjTrx-1/pET28a,在E.coli中实现了重组SjTrx-1蛋白的可溶表达,其相对分子质量(Mr)约为38 000,与预测的融合蛋白大小相符。经组氨酸标签亲和层析法获得纯化重组蛋白SjTrx-1,并测定了其体外的酶催化活性。虫期转录特异性分析显示,该基因在各个虫期均存在转录,其中胞蚴、童虫和成虫阶段的丰度较高,毛蚴和尾蚴中含量相对较低。荧光定位结果显示,SjTrx-1蛋白在虫体内分布广泛,且无组织特异性。结论 SjTrx-1在日本血吸虫虫体内分布广泛,在胞蚴、童虫和成虫阶段的丰度较高。
- 刘建徐斌张晓刘璐胡薇王小宁
- 关键词：日本血吸虫硫氧还蛋白-1免疫定位
- 日本血吸虫虫卵cDNA文库的免疫筛选和阳性克隆的鉴定被引量：5
- 2012年
- 目的寻找可用于日本血吸虫病诊断或疗效考核的抗原分子。方法在安徽省安庆市某现场,采集经粪检(Kato-Katz法,2送6检)日本血吸虫卵阳性的10份患者血样,患者年龄13～64岁,EPG为4～172;并收集该10例患者经吡喹酮(60 mg/kg×2 d)治疗6个月后的血样,将吡喹酮治疗前和治疗后的血清各10份分别混合,分别筛选虫卵cDNA文库,将所获阳性克隆分类,测定阳性克隆插入片段的DNA序列,经BLAST程序分析同源性,并利用在线的生物信息学软件预测阳性克隆基因编码蛋白的结构和功能。结果初次筛选共获得75个阳性克隆,其中46个阳性克隆吡喹酮治疗前和治疗后的日本血吸虫病患者血清反应一致(为Ⅰ类),21个阳性克隆吡喹酮治疗前的血清强于治疗后的(为Ⅱ类);8个阳性克隆吡喹酮治疗后的血清强于治疗前的(为Ⅲ类)。结合反应强度、分类和插入片段的大小选择了14个阳性克隆进行测序和生物信息学分析,多数阳性克隆插入片段均属于虫卵毛蚴抗原家族,1个阳性克隆的插入片段与含EF-hand结构域的钙结合蛋白具有一定的同源性(分值=143),1个阳性克隆的插入片段与应激反应组分1前体具有较高的同源性(分值=487),其余阳性克隆的插入片段仅与假定蛋白有一定的同源性,蛋白功能无明确注释。结论用吡喹酮治疗前后的日本血吸虫病患者血清筛选虫卵cDNA文库,获得的29个阳性克隆在吡喹酮治疗前后有差异。
- 卢艳徐斌鞠川莫筱瑾陈绅波冯正王小宁胡薇
- 关键词：日本血吸虫虫卵CDNA文库免疫筛选疗效考核
- Kato-Katz法2送6检结合粪孵法用于血吸虫病现场筛查被引量：8
- 2011年
- 目的探讨敏感性、准确性较高的血吸虫病病原学检查新方法。方法以血吸虫病流行区湖北省武汉市汉南区捞子湖村居民为对象,连续2d每天收集1次新鲜粪便样本,并采用加藤厚涂片法(Kato-Katz法)顺序制作6张涂片,检测粪便中血吸虫卵(2送6检);对检测阴性者再采用尼龙绢集卵孵化法对粪便样本复检,进行阳性检出率和克粪虫卵数(EPG)值的比较。同时收集相关的流行病学基础资料。结果 Kato-Katz法共检测562人,阳性67例;对Kato-Katz法检测阴性的495人进行粪孵法复检,阳性6例;两法检出总阳性者73例。以阳性病人73例计算,Kato-Katz法1送3检累计阳性为48例,累计阳性率为65.8%,漏检率为34.25%,2送6检累计阳性为67例,累计阳性率为91.8%,漏检率为8.22%,随着检测次数的增加,阳性检出率逐渐升高。6次累计阳性率比单次平均阳性率提高53.50%。病人EPG几何均数1～6片分别为61.12、31.92、23.71、20.88、19.35和18.83,显示涂片数较少时病人EPG偏高,病人EPG的准确性随涂片数增加而提高。结论为获得较高的血吸虫病检出率和准确的人群感染度,Kato-Katz法2送6检结合粪孵法值得应用。
- 徐斌冯正徐兴建胡薇
- 关键词：血吸虫病KATO-KATZ法检出率
- 日本血吸虫P7抗原的克隆表达、虫期特异性分析以及早期诊断价值的研究被引量：4
- 2011年
- 目的克隆表达日本血吸虫(Schistosoma japonicum)P7抗原片段(GenBank登录号为EU121231),研究各虫期中该目的片段的转录和表达情况,初步评价其作为早期诊断抗原的潜力。方法将日本血吸虫童虫cDNA文库中免疫筛选出的阳性克隆P7进行体外扩增,将目的基因亚克隆至原核表达载体pET28a中。用双酶切的方法鉴定重组质粒,将阳性重组质粒转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞中,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达并纯化。用蛋白质印迹(Western blotting)分析初步鉴定表达产物的免疫诊断价值。利用逆转录PCR和Westernblotting分析检测P7片段在日本血吸虫各个虫期中的转录和表达情况。以P7重组蛋白为抗原用间接ELISA检测感染日本血吸虫后14 d的兔血清(18份),日本血吸虫病(28份)、华支睾吸虫病(30份)和卫氏并殖吸虫病(20份)患者血清,以及健康人血清(30份),计算特异性和敏感性。结果成功构建了重组表达载体P7/pET28a,并在E.coli中表达。Western blotting分析结果显示P7重组蛋白能被感染日本血吸虫后14 d的小鼠血清和P7重组蛋白免疫的多抗兔血清识别,但不能被感染后42 d的小鼠血清识别,蛋白相对分子质量(Mr)约为20 100。采用逆转录PCR技术在尾蚴、童虫和成虫中均检测到了P7片段的mRNA。Western blotting分析结果显示,仅在童虫阶段检测到目的蛋白。间接ELISA检测感染早期兔血清的检出率为83.3%(15/18),检测日本血吸虫病患者血清的敏感性为75.0%(21/28),特异性为93.8%(75/80),与华支睾吸虫病和卫氏并殖吸虫病患者血清的交叉反应分别为6.7%(2/30)和5.0%(1/20)。结论日本血吸虫P7抗原可能为潜在的日本血吸虫病早期诊断的靶分子。
- 徐斌段新伟卢艳陈绅波冯正胡薇
- 关键词：日本血吸虫
- 日本血吸虫核糖体蛋白SjRibosom al_L18a及其B细胞表位的筛选和评价
- 2013年
- 目的筛选获得日本血吸虫(Schistosoma japonicum)核糖体蛋白(SjRibosomal_L18a)编码基因,预测其B细胞表位。克隆、表达重组蛋白SjRibosomal_L18a,并比较分析其与合成的B细胞表位的潜在诊断价值。方法利用B细胞表位预测软件筛选日本血吸虫蛋白质序列,获取函数打分值较高且抗原表位片段多的免疫原性蛋白,合成B细胞表位片段。生物信息学方法分析免疫原性蛋白基因及其编码蛋白的相对分子质量(M r)、等电点、亲水性、信号肽、跨膜区和功能结构域等理化性质。制备日本血吸虫各虫期阶段总RNA,逆转录PCR(RT-PCR)扩增目的基因,分析各虫期转录本丰度。将扩增产物克隆至原核表达载体pET-28a中,重组质粒转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3)菌株,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,组氨酸标记亲和层析法纯化重组蛋白。ELISA法比较分析重组蛋白和合成的B细胞表位的潜在诊断价值。结果预测软件筛选出免疫原性核糖体蛋白SjRibosomal_L18a以及2个B细胞表位(P1和P2)。SjRibosomal_L18a基因开放阅读框(ORF)由531个碱基组成,编码176个氨基酸,不含跨膜区和信号肽,为M r20 741,等电点为11.12。RT-PCR结果显示,各虫期均检测到SjRibosomal_L18a的转录本,且转录水平均较高。成功构建重组表达质粒SjRibosomal_L18a/pET-28a,诱导表达获得包涵体形式的重组蛋白,约为M r26 069。ELISA检测结果显示,重组蛋白、P1和P2检测15份慢性血吸虫病患者血清和15份健康人血清的敏感性和特异性分别为53.3%(8/15)和100%(15/15)、60%(9/15)和100%(15/15)、73.3%(11/15)和100%(15/15)。结论获得重组蛋白SjRibosomal_L18a及其免疫原性较高的表位片段P1、P2,P1和P2用于血清诊断的敏感性均高于重组蛋白。
- 魏刚刚徐斌鞠川胡薇
- 关键词：日本血吸虫B细胞表位核糖体蛋白
