国家自然科学基金(30271318)
- 作品数：22 被引量：95H指数：7
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- AAV-TGFβ3的构建及其与AV-TGFβ1表达系统对反分化髓核细胞蛋白多糖合成的影响被引量：1
- 2006年
- 目的:比较转化生长因子(TGF)β3腺相关病毒(AAV-TGFβ3)与TGFβ1腺病毒(AV-TGFβ1)表达系统对反分化早、晚期髓核细胞蛋白多糖合成的生物学效应。方法:制备具有感染活性的AAV-TGFβ3并采用酶切电泳和免疫荧光对其进行鉴定。将AAV-TGFβ3和AV-TGFβ1分别转染反分化早、晚期髓核细胞,采用免疫印迹法检测TGFβ3和TGFβ1蛋白的表达,并通过Antonopulos法分别检测AAV-TGFβ3和AV-TGFβ1对蛋白多糖合成的生物学效应。结果:AAV-TGFβ3转染可提高反分化早、晚期髓核细胞TGFβ3蛋白的表达,并促进其蛋白多糖的合成。转染后第12天,蛋白多糖含量达到峰值,分别为0.399±0.029和0.152±0.011,此后蛋白多糖含量缓慢降低;于转染后第2个月,蛋白多糖含量稳定在较高水平,分别为0.309±0.021和0.115±0.009。AV-TGFβ1转染亦可提高反分化早、晚期髓核细胞TGFβ1蛋白的表达,但其仅促进反分化早期髓核细胞蛋白多糖的合成,转染后第10天蛋白多糖含量达到峰值(0.413±0.041),此后蛋白多糖含量快速降低,转染后第2个月时蛋白多糖含量降至较低水平(0.198±0.013);对于反分化晚期髓核细胞,AV-TGFβ1则抑制其蛋白多糖的合成。结论:AAV-TGFβ3可稳定地促进反分化早、晚期髓核细胞蛋白多糖的合成;AV-TGFβ1仅一过性地促进反分化早期髓核细胞蛋白多糖的合成,而且抑制反分化晚期髓核细胞蛋白多糖的合成。
- 赛佳明胡有谷王德春
- 关键词：转化生长因子Β3髓核蛋白多糖
- 腺相关病毒载体介导结缔组织生长因子对体外转染恒河猴和人腰椎间盘细胞蛋白多糖和Ⅱ型胶原影响的比较被引量：1
- 2009年
- 目的比较腺相关病毒载体介导结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)对体外培养的恒河猴和人腰椎间盘细胞转染后蛋白多糖含量和Ⅱ型胶原的影响。方法将恒河猴及成人腰椎间盘髓核细胞进行体外培养,应用rAAV2-CTGF体外转染细胞,分别通过^(35)S标记蛋白多糖的方法和Ⅱ型胶原的SP-ABC免疫组化法检测腺相关病毒载体介导生长因子对椎间盘细胞蛋白多糖合成和Ⅱ型胶原的影响。结果恒河猴椎间盘细胞能进行体外培养并传代,其形态学特性与培养的成人椎间盘细胞相似,rAAV2-CTGF与对照组相比可促进恒河猴和人椎间盘髓核细胞的蛋白多糖生物合成(P<0.01),恒河猴和成人相比生长因子对于蛋白多糖的促进作用无明显差异(P>0.05)。结论成功培养恒河猴及成人椎间盘细胞,腺相关病毒载体介导CTGF能显著促进髓核细胞蛋白多糖的合成,生长因子对恒河猴和人椎间盘细胞蛋白多糖含量的影响具有很大的相似性。
- 刘勇孔杰魏见伟胡有谷
- 关键词：结缔组织
- AAV_2-hVEGF_(165)与AAV_2-hTGFβ_1对退变兔椎间盘纤维环细胞的生物学效应
- 2008年
- 目的采用基因治疗方法,把AAV2-hVEGF165和AAV2-hTGFβ1共转染兔纤维环细胞,观察其生物学活性,并进一步评价人血管内皮生长因子16(5hVEGF165)和人转化生长因子β(1hTGFβ1)逆转椎间盘退变的可行性。方法分离并培养兔椎间盘纤维环细胞,以腺相关病毒(AAV2)为载体,分别携带hVEGF165和hTGFβ1cDNA,转染兔纤维环细胞。用Western blotting检测hVEGF165和hTGFβ1的表达,并用同样的方法检测纤维环细胞中Ⅰ型胶原的表达。结果AAV2能够感染兔椎间盘细胞。用Western blotting可以检测到AAV2-hVEGF165和AAV2-hTGFβ1在退变椎间盘细胞中的表达,并且,两种因子联合转染纤维环细胞时Ⅰ型胶原的表达要比分别转染是显著增高。结论hVEGF165和hTGFβ1共同转染培养的兔退变纤维环细胞,Ⅰ型胶原的表达显著增高。
- 董跃福牟志芳石法亮胡有谷
- 关键词：腺相关病毒
- AAV-TGFβ_1的构建及其与AV-TGFβ_1对髓核细胞蛋白多糖合成影响的比较被引量：1
- 2008年
- 目的探讨转化生长因子β1腺相关病毒表达系统(AAV-TGFβ1)的构建及其与转化生长因子β1腺病毒表达系统(AV-TGFβ1)对髓核细胞蛋白多糖合成影响的比较。方法采用PCR技术扩增转化生长因子β1(TGFβ1)基因,并于其两端分别连接EcoRI和SalI酶切位点。将TGFβ1基因亚克隆于腺相关病毒(AAV)载体中,并经酶切和测序分析进行鉴定。AAV-TGFβ1病毒被包装并转染H293细胞,通过免疫荧光检测AAV介导的目的基因表达。利用AAV-EGFP病毒检测AAV对髓核细胞的转染效率。AAV-TGFβ1和AV-TGFβ1分别转染髓核细胞后,通过Antonopulos法检测蛋白多糖的合成。结果测序分析证明TGFβ1序列与NCBI Gene Bank所报道的一致。经酶切鉴定证实AAV-TGFβ1重组质粒被成功构建。AAV可介导TGFβ1高效表达并高效转染髓核细胞。AV-TGFβ1可快速一过性地促进髓核细胞蛋白多糖合成,而AAV-TGFβ1可稳定促进蛋白多糖合成。结论AAV-TGFβ1病毒被成功构建并可稳定地促进髓核细胞蛋白多糖的合成。
- 赛佳明胡有谷王德春
- 关键词：腺相关病毒髓核蛋白多糖
- 椎间盘的营养与退变被引量：13
- 2006年
- 刘海飞王德春胡有谷
- 关键词：椎间盘退变营养供应血管组织病理基础代谢废物
- 兔退变椎间盘体内转染hTGF－β1、β3的生物学效应被引量：3
- 2011年
- 目的 应用重组腺相关病毒2（recombinant adeno-associated virus,rAAV2）介导人转化生长因子β1（human transforming growth factor-β1,hTGF-β1）和β3（hTGF-β3）单基因或双基因联合体内转染退变兔髓核细胞,观察基因产物的表达及其对基质成分蛋白多糖和Ⅱ型胶原合成的生物调节作用.方法 36只新西兰大白兔注射纤维结合素片段（fibronectin fragment,Fn-f）制造椎间盘退变模型.造模成功后,随机分为5组：实验A组8只,造模椎间盘髓核内注射rAAV2-hTGF-β1;实验B组6只,注射rAAV2-hTGF-β3;实验C组6只,联合注射rAAV2-hTGF-β1和rAAV2-hTGF-β3;实验对照D组8只,注射rAAV2介导的增强绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein,EGFP）;空白对照E组8只,髓核内注射PBS.1周后处死A组及E组中各2只兔,收获髓核组织,制作冰冻切片,免疫组化法观察hTGF-β1的表达;基因转导后4、8、12周每组处死2只兔取髓核组织组织培养和裂解,35S整合分析法检测新合成蛋白多糖的含量,免疫印迹法检测髓核Ⅱ型胶原的含量.术后12周时处死D组剩余的2只兔,观察EGFP的表达.结果 （1）术后1周,免疫组化染色显示A组髓核组织切片中髓核细胞内及细胞间hTGF-β1阳性表达较E组显著增多,基因产物大量有效表达;（2）术后4、8、12周实验A组、B组、C组基因转染后蛋白多糖表达较E组提高1.28～2.06倍,Ⅱ型胶原表达提高1.25～1.73倍,差异均有统计学意义;C组蛋白多糖表达较A组、B组提高1.195～1.290倍,Ⅱ型胶原表达较A组、B组提高1.152～1.219倍,差异有统计学意义;A组、B组间或D组、E组间蛋白多糖及Ⅱ型胶原表达差异均无统计学意义;（4）术后12周,D组髓核细胞胞质内及细胞间质中观察到大量绿色荧光,基因产物EGFP仍有大量表达.结论 AAV作为新型基因转导载体可以有效介导治疗基因体内转染兔退变的髓核细胞,基因转染1周目的 基因即大量表达且持续表达超过12�
- 刘海飞宁斌王德春胡有谷
- 关键词：椎间盘转化生长因子B转染基因疗法
- AAV-hVEGF_(165)及AAV-TGFβ1转染兔椎间盘纤维环细胞的实验研究被引量：14
- 2006年
- 目的探讨应用hVEGF165与TGFβ1基因逆转椎间盘退变的可行性。方法用分子克隆技术,从pcDNA3(+)-hVEGF165获得hVEGF165cDNA,并克隆至AAV包装质粒pSNAV上,构建成pSNAV-hVEGF165的AAV重组质粒。经酶切及测序鉴定后,用脂质体介导pSNAV-hVEGF165转染HEK293细胞和血管内皮细胞。荧光免疫组化方法检测hVEGF165蛋白,并用MTT法测定hVEGF165对血管内皮细胞增殖的影响。由本元正阳公司对pSNAV-hVEGF165进行AAV-hVEGF165包装。AAV-hVEGF165与AAV-TGFβ1联合转染退变的椎间盘纤维环细胞,Westernblot检测hVEGF165与TGFβ1的表达以及纤维环细胞Ⅰ型胶原表达量的变化。结果经酶切鉴定及基因测序证实AAV包装质粒pSNAV-hVEGF165构建完成,荧光免疫组化显示hVEGF165蛋白表达,MTT法显示hVEGF165蛋白对血管内皮细胞增殖有促进作用。本元正阳公司包装出具有生物学功能的AAV-hVEGF165,AAV-hVEGF165构建成功。Westernblot显示hVEGF165与TGFβ1在纤维环细胞中表达,AAV-hVEGF165与AAV-TGFβ1双基因联合转染的纤维环细胞Ⅰ型胶原表达量较hVEGF165与TGFβ1基因各自单独转染的细胞Ⅰ型胶原表达量明显增多。结论hVEGF165在体外能够协同TGFβ1促进退变纤维环细胞Ⅰ型胶原表达增加。
- 董跃福胡有谷王德春
- 关键词：血管内皮生长因子A转化生长因子Β椎间盘
- AAV-hTGFβ1基因体内转染羊椎间盘对髓核细胞Ⅱ型胶原的影响被引量：1
- 2007年
- 目的观察腺相关病毒(AAV)介导人转化生长因子β1(hTGFβ1)基因体内转染羊椎间盘后,对其Ⅱ型胶原的影响。方法SPF级山羊8只,共取椎间盘32个,实验组、对照组各16个。实验组椎间盘显微注射AAV-hTGFβ1,对照组注射磷酸盐缓冲液(PBS)。术后4周对山羊腰椎间盘行免疫组织化学观察,采用VIDAS图像分析系统进行半定量分析。结果实验组Ⅱ型胶原表达明显高于对照组,差异有统计学意义(t=3.521,P<0.05)。结论AAV-hTGFβ1基因体内转染后能提高椎间盘细胞Ⅱ型胶原的表达。
- 刘勇胡鹏胡有谷齐宗华
- 关键词：转化生长因子Β椎间盘
- 腰椎间盘细胞培养方法探讨
- 2006年
- 目的寻找使椎间盘细胞更具生物学活性的培养方法。方法将25例胎儿及成人腰椎间盘细胞分为A组(足月胎儿)、B组(18～24岁)、C组(25～34岁)、D组(35～44岁)、E组(45～55岁),均分别进行单层培养和立体培养,培养检测Ⅰ、Ⅱ型胶原(CⅠ、CⅡ)的含量。结果C、D、E组立体培养较单层培养C、C含量明显增高(P均<0.05)。结论立体培养细胞具有更大的生物学活性,有助于椎间盘细胞生物学的进一步研究。
- 刘勇胡有谷宁斌齐宗华
- 关键词：椎间盘
- 椎间盘退行性变的生物学治疗研究进展被引量：8
- 2006年
- 刘海飞王德春胡有谷
- 关键词：椎间盘退行性变生物学治疗椎间盘退变椎间盘突出症椎间盘组织病理基础
