国家自然科学基金(30271316)
- 作品数：7 被引量：12H指数：2
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- 相关机构：郑州大学第一附属医院山东大学上海交通大学附属第六人民医院更多>>
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- NF-κB抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷提高卵巢癌细胞顺铂化疗的敏感性被引量：4
- 2008年
- 目的:探讨核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)提高人卵巢癌SKOV-3细胞对顺铂(cisplatin)化疗敏感性的作用及其可能的机制。方法:用不同浓度PDTC联合顺铂在不同时间作用于卵巢癌SKOV-3细胞,MTT法观察药物作用对细胞生长的抑制,Western Blotting分析胞质内NF-κB抑制蛋白α(inhibitor of NF-κB,I-κBα)、胞核P65蛋白的表达;流式细胞术检测细胞凋亡。结果:PDTC(10 ～40μmol/L)或顺铂(0.1 ～100μg/ml)均明显抑制SKOV-3细胞的生长(P<0.05或P<0.01),并引起细胞的凋亡;小剂量PDTC(2.5、5μmol/L)和顺铂(0.01μg/ml)联合应用与单用顺铂比较,可明显增加细胞生长抑制率和细胞凋亡率(均P<0.05)。单用顺铂组与对照组比较,胞质I-κBα蛋白减少而胞核P65蛋白增多,联合使用PDTC可逆转此现象。结论:小剂量PDTC可增强卵巢癌细胞对顺铂的敏感性,这一作用可能与PDTC增加I-κBα蛋白的表达而抑制P65蛋白进入核内有关。
- 刘国红王波
- 关键词：二硫代氨基甲酸吡咯烷顺铂卵巢肿瘤NF-ΚB
- 动态模板PCR合成分泌性降钙素基因及其克隆
- 2005年
- 目的用动态模板PCR基因合成法合成与克隆含人胰岛素分泌信号的人降钙素(humancalcitoninhCT)基因并经序列分析予以确证。方法根据Genebank的人胰岛素分泌信号和人的hCT基因的序列,将其分成6个片断合成单链寡核苷酸作为PCR的引物和cDNA合成的模板。其中,在互相邻近的每两条引物之间均有19～20个碱基互补,6条合成的单链寡核苷酸在PCR反应中相邻的两条单链寡核苷酸互为引物和模板,经过3个PCR循环,直接扩增出人胰岛素和降钙素的编码序列,经过25～30循环,获得足量的PCR产物,即含人胰岛素分泌信号的hCT基因。采用琼脂糖凝胶回收法,回收目的片段胰岛素分泌信号和hCT基因全长DNA。纯化后,将此段DNA插入到克隆载体PMD18-T载体上。转化用CaCl2法制备的感受态细菌JM109,恒温震荡培养箱培养1h后,涂在含氨苄青霉素和X-gal的LB固体培养基上培养。利用氨苄抗性筛选和蓝白斑筛选实验,筛选出阳性克隆,用碱裂解法提取质粒,应用双酶切和DNA测序鉴定重组质粒。结果经动态模板PCR基因合成法合成获得212bp产物,经酶切鉴定和DNA测序确定所合成片断为胰岛素分泌信号和hCT基因全长,证明克隆到的含人胰岛素分泌信号和降钙素的基因为编码人胰岛素分泌信号和人降钙素的全长DNA序列。结论本研究为基因合成提供了一种新的可靠的方法,成功地克隆了含人胰岛素分泌信号的人降钙素基因,为人降钙素基因与后续研究提供了新的研究方法。
- 王秀利王义生
- 关键词：降钙素基因克隆降钙素基因克隆载体合成法分泌性
- 合成人降钙素基因实验研究的初步报告被引量：2
- 2004年
- 目的 :合成含人胰岛素分泌信号的人降钙素基因。方法 :将人胰岛素分泌信号和人降钙素基因的序列分成六个片断合成单链寡核苷酸作为PCR的引物和cDNA合成的模板。应用动态模板PCR反应直接扩增出人胰岛素和降钙素的编码序列。结果 :经含EB的 1.5 %琼脂糖凝胶电泳 ,证明合成的基因含编码人胰岛素分泌信号和人降钙素的全长DNA序列。结论 :本研究为基因合成提供了一种新的可靠方法。
- 王秀利王义生姜国忠李晓林
- 关键词：降钙素基因人胰岛素琼脂糖凝胶电泳PCR反应基因合成CDNA合成
- 重组成肌细胞合成人降钙素促进大鼠成骨细胞增殖和分化(英文)被引量：4
- 2007年
- 背景:大剂量多次喷鼻或者肌注降钙素能有效地预防绝经后妇女脊柱骨的丢失。但是降钙素需要长时期反复用药、价格昂贵、且有弱的抗原性,限制了长期使用。基因治疗可以为骨质疏松症提供更加有效、经济的治疗方案,同时减少药物的副作用。目的:观察人降钙素基因在成肌细胞中的表达,分析重组人降钙素对体外大鼠成骨细胞的影响。设计:以基因为实验对象,对比观察实验。单位:复旦大学放射医学研究所。材料:实验于2005-12/2006-06在复旦大学放射医学研究所完成。选用健康SD胎鼠10只,由复旦大学放射医学研究所提供。人降钙素单克隆抗体购于美国Santa Cruz生物技术公司。L6成肌细胞由中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所提供。方法:在L6成肌细胞培养基中分别加入pcDNA3.0-hCT脂质体转染混合物(转染组)和空载体pcDNA3.0脂质体混合物(对照组)进行培养。采用ELISA法、Western Blot和免疫组织化学鉴定目的基因的蛋白表达。在成骨细胞培养基中分别加入1×10-14,1×10-13,1×10-12mol/L重组人降钙素和MEM。主要观察指标:利用MTT和检测碱性磷酸酶活性的方法观察大鼠成骨细胞增殖和分化的变化。结果:ELISA法可在细胞培养液中检测到降钙素蛋白;Western blot及免疫组化均证实人降钙素在转染后的成肌细胞中获得稳定表达。当重组人降钙素的浓度为1×10-14,1×10-13mol/L时成骨细胞活性和成骨细胞碱性磷酸酶活性较对照组增高,但差异无显著性意义(P>0.05);浓度升高为1×10-12mol/L时,明显高于对照组(P<0.05)。结论:借助基因转染的方法,成肌细胞可以稳定合成、分泌人降钙素。重组人降钙素有促进骨形成的作用。
- 王烨明曾炳芳李晓林
- 关键词：基因治疗绝经后骨质疏松成肌细胞
- 稳定表达人降钙素基因大鼠成肌细胞株的建立
- 2007年
- 目的:建立稳定表达人降钙素(hCT)基因的细胞株(L6),观察人降钙素基因在大鼠成肌细胞中的表达和分泌情况。方法:实验于2004-06/2005-11在河南省肿瘤病理重点实验室完成。用已构建的5’端融合小鼠抗体轻链基因Igκ的信号肽序列的人降钙素基因分泌性真核表达载体pCDNA3.0-Igκ-hCT,采用脂质体介导方法将人降钙素基因导入大鼠成肌细胞;对照组用pCDNA3.0空质粒转染。经G418筛选后,用反转录-聚合酶链反应法和免疫细胞化学法检测人降钙素基因在大鼠成肌细胞中的表达,并用放免法检测细胞培养上清液降钙素的分泌。结果:①反转录-聚合酶链反应法检测人降钙素基因的表达:反转录-聚合酶链反应扩增后,重组质粒载体转染组成肌细胞总RNA中检测到人降钙素基因的表达,而空载体转染组和未转染成肌细胞均未检测出目的基因(210bp);β-肌动蛋白为内对照约385bp。②免疫细胞化学法测定降钙素的表达:pCDNA3.0-Igκ-hCT转染组成肌细胞浆被黄染,提示有人降钙素表达;而空载体组胞浆染色阴性,无人降钙素表达。③细胞培养上清液中降钙素的含量:pCDNA3.0-Igκ-hCT重组载体转染组(hCT)1～10代细胞培养上清液人降钙素浓度差异无显著性(P>0.05),明显高于同代空载体转染组(pCDNA3.0)(P<0.001)。结论:稳定表达人降钙素基因的大鼠成肌细胞株成功建立,为进一步体内移植治疗骨质疏松症打下基础。
- 杨恺李晓林姜国忠许建中王义生
- 关键词：降钙素基因成肌细胞骨质疏松
- 二硫代氨基甲酸吡咯烷增敏多西他赛对卵巢癌细胞毒性作用的机制研究被引量：1
- 2006年
- 目的:探讨核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)活化抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(Pyrrolidine Dithiocarbamate,PDTC)对多西他赛(Docetaxel)致卵巢癌SKOV-3细胞毒性作用的影响。方法:用不同浓度PDTC、Docetaxel以不同时间间隔作用于卵巢癌SKOV-3细胞,MTT法观察细胞生长抑制,West-ern Blot法分析胞浆内NF-κB抑制蛋白α(inhibitor of NF-κB,I-κB-α)、胞核P65蛋白表达;流式细胞术检测细胞凋亡。结果:Docetaxel(≥1 mg/L)或PDTC(≥10μmol/L)均明显抑制SKOV-3细胞的生长,引起细胞凋亡;小剂量PDTC(2.5、5μmol/L)和Docetaxel(0.01 mg/L)联合应用与单用Docetaxel比较,可明显抑制细胞生长,增加细胞凋亡率;单用Docetaxel组与对照组比较,胞浆I-κB-α蛋白减少而胞核P65蛋白增多,加用PDTC可逆转此现象。结论:小剂量PDTC可增强卵巢癌细胞对Docetaxel的敏感性,这一作用与PDTC抑制P65蛋白进入核内有关。
- 刘国红王苏荣王波
- 关键词：多西他赛二硫代氨基甲酸吡咯烷核因子-ΚB
- 人降钙素基因在成肌细胞中表达的实验研究初步报告被引量：1
- 2006年
- 目的将携带人降钙素(CT)基因的真核表达载体pcDNA3.0-hCT转染L-6成肌细胞,检测该基因在成肌细胞中的表达,为下一步基因治疗奠定基础。方法利用L ipofectam ineTM2000转染pcDNA3.0-hCT到L-6成肌细胞中;经G418筛选成功后,用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)法检测人降钙素基因的表达,并检测细胞外分泌情况。结果从分子水平上成功检测到降钙素基因的表达;并且在培养液中检测到了平均42.22ng/106/24h浓度降钙素分泌。结论成功转染人降钙素基因真核表达载体pcDNA3.0-hCT于成肌细胞中,并可以在其中持续稳定地表达。
- 杨恺李晓林许建中王义生
- 关键词：降钙素成肌细胞基因表达
