国家自然科学基金(30271319)
- 作品数：5 被引量：14H指数：2
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- 重组BMP7真核表达载体的构建及其对关节软骨细胞的转染被引量：1
- 2005年
- 目的:构建pcDNA3.1-BMP7真核表达载体,并探讨转染关节软骨细胞的脂质体和DNA的最佳比例及BMP7基因表达。方法:构建pcDNA3.1-BMP7真核表达载体。用脂质体将pcDNA3.1-BMP7包裹形成DNA脂质体复合物,转染家兔关节软骨细胞,G418筛选。转染过程中确定脂质体浓度、脂质体与pcDNA3.1-BMP7质粒的比例。原位杂交、PCR、Western blotting测定BMP7表达。结果:构建了pcDNA3.1-BMP7真核表达载体,脂质体与pcDNA3.1-BMP7质粒最佳转染浓度为3 mL培养液中加10μL脂质体和4μg pcDNA3.1-BMP7质粒(2.5∶1);以400 mg.L-1G418的正常培养液筛选28 d,BMP7为阳性表达。结论:在脂质体介导下,pcDNA3.1-BMP7转染家兔关节软骨细胞获得成功,且BMP7在该细胞中稳定表达。
- 曲福军侯宜戚良晨刘丽玲池光范侯立中
- 关键词：软骨细胞骨形成蛋白-7真核表达载体
- 家兔关节软骨骨形成蛋白-7成熟肽基因克隆及序列测定被引量：1
- 2004年
- 目的 证实家兔膝关节软骨中骨形成蛋白-7(BMP-7)的表达,获得BMP-7成熟肽基因。方法 提取家兔膝关节细胞总RNA,反转录合成cDNA,以特异性引物扩增BMP-7成熟肽基因并克隆人T载体,筛选阳性克隆质粒进行核酸序列分析。结果 PCR扩增得到一特异性的约630 bp片段,克隆后筛选出阳性克隆质粒,序列测定结果表明与发表的BMP-7成熟肽基因序列一致。结论 家兔膝关节软骨细胞中有BMP-7成熟肽基因的表达,克隆得到了BMP-7成熟肽基因,为BMP-7在软骨发育中的作用及其功能研究奠定了基础。
- 曲福军侯宜刘丽玲陈化兰侯立中
- 关键词：家兔关节软骨骨形成蛋白-7成熟肽
- 应用转BMP7基因软骨细胞构建组织工程软骨被引量：8
- 2006年
- 目的:利用转BMP7基因软骨细胞构建组织工程软骨,测定BMP7基因在构建的组织工程软骨中的表达,探讨与未转BMP7基因软骨细胞构建的组织工程软骨的生物学差异。方法:实验于2004-06/2005-01在哈尔滨医科大学附属第二医院临床药学药物研究所完成。应用转染重组pcDNA3.1-BMP7真核表达载体质粒并用G418筛选14d的阳性克隆软骨细胞,以胶原-纤维蛋白凝胶为支架,构建转BMP7基因组织工程软骨。以未转BMP7基因组织工程软骨作为对照,软骨细胞的接种密度为5×109L-1。用甲苯胺蓝、苏木精-伊红染色对组织工程软骨培养物组织学分析;原位杂交法检测Ⅱ型胶原mRNA的表达;透射电镜观察组织工程软骨培养物的超微结构;原位杂交和免疫组化法测定体外培养物BMP7mRNA和蛋白的表达。结果:①BMP7基因转染软骨细胞情况:G418筛选7d时大量细胞死亡,约30%的细胞存活,且贴壁生长。G418连续筛选14,28d均有阳性克隆细胞生成,贴壁生长率100%,存活的阳性克隆细胞为转染成功的软骨细胞。②组织工程软骨培养物大体形态及显微镜观察结果:构建的组织工程软骨培养物呈浅粉红色胶冻样圆盘状,透明,体积约为16mm×16mm×3mm。显微镜下只能观察到呈圆形的浅层细胞。③组织工程软骨培养物组织学分析结果:组织工程软骨培养物体外培养7,14,28d,细胞周围有丰富的细胞外基质,转BMP7基因组织工程软骨培养物细胞基质较多,体外培养14d软骨细胞合成和分泌最为活跃。④组织工程软骨培养物Ⅱ型胶原表达mRNA原位杂交检测结果:软骨细胞核周围呈棕黄色,有mRNA表达。⑤不同培养时间下组织工程软骨培养物DNA含量的测定情况:DNA含量随着培养时间的推移逐渐增加,21d时达到高峰,转BMP7基因比未转染BMP7基因的组织工程软骨培养物DNA含量高(P<0.05)。⑥不同培养时间下组织工程软骨培养物糖胺多糖含量的测定情况:转BMP
- 曲福军侯宜刘丽玲周余来侯立中
- 关键词：生物医学工程转基因软骨细胞
- BMP7基因克隆及其在兔关节软骨细胞中的表达
- 2006年
- 目的:克隆骨形态发生蛋白BMP7基因并检测其在体外培养的兔关节软骨细胞中的表达。方法:从体外培养的幼兔膝关节软骨细胞中提取总RNA;按GenBankBMP7基因序列化学合成2条引物,采用RT-PCR方法得到BMP7基因;将BMP7基因片段插入到真核表达载体pcDNA3·1中,构建pcDNA3·1-BMP7真核表达载体质粒;利用双酶切、PCR及核苷酸序列分析鉴定BMP7目的基因;将重组pcDNA3·1-BMP7真核表达载体质粒转染家兔关节软骨细胞,分别采用原位杂交、PCR、Westernblotting法测定BMP-7表达。结果:克隆得到的BMP7基因核苷酸序列长约1300bp,构建的重组pcDNA3·1-BMP7真核表达载体质粒目的基因BMP-7序列与GenBank报道的BMP-7基因(No·BC008584)一致,转染了BMP7基因的体外培养的成年家兔膝关节软骨细胞表达了BMP7蛋白。结论:成功构建表达BMP7蛋白的转基因关节软骨细胞,其可用于细胞移植治疗或作为种子细胞构建组织工程软骨修复关节软骨缺损。
- 曲福军戚良晨侯宜侯立中
- 关键词：骨形态发生蛋白质类软骨细胞
- 重组pcDNA3.1-BMP7转染兔膝关节软骨细胞及其表达被引量：4
- 2006年
- 目的:将重组pcDNA3.1-BMP7真核表达载体转染至培养的兔膝关节软骨细胞中,观察BMP7基因在兔关节软骨细胞中的表达。方法:实验于2003-08/2004-08在哈尔滨兽医研究所完成。①选取清洁级健康成年家兔1只,兔膝关节软骨切碎后取2.0～2.5kg软骨组织,进行关节软骨细胞的分离与培养。②脂质体与pcDNA3.1-BMP7DNA质粒形成脂质体-DNA质粒复合物,复合物的最佳比例为脂质体10μL、pcDNA3.1-BMP7质粒4μg。用含G418400mg/L的正常培养液筛选转染pcDNA3.1-BMP7DNA质粒的软骨细胞,显微镜观察细胞的形态及活性。③软骨细胞转染后7d和28d,分别用聚合酶链式反应、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Westernblot、免疫荧光、原位杂交检测等方法测定BMP7蛋白在软骨细胞中的表达。结果:①家兔膝关节软骨细胞的分离与培养情况:家兔膝关节软骨切碎后用胰蛋白酶/Ⅱ型胶原酶进行消化,能使细胞与细胞外基质很好地分离。接种24h,部分细胞开始贴壁生长,72h后分裂增殖,7d时细胞融合率为90%～100%。贴壁初期细胞呈圆形或三角形,以三角形为主,每7d传代1次。②脂质体介导下pcDNA3.1-BMP7质粒转染兔软骨细胞情况:转染后的软骨细胞用G418筛选,4d转染效率约15%,阳性克隆细胞七八天融合率约为90%。G418连续筛选28d,阳性克隆细胞仍然存活,细胞融合率为100%。未转染pcDNA3.1-BMP7质粒的细胞,G418筛选4d时细胞全部死亡。③转染后兔软骨细胞聚合酶链式反应检测结果:聚合酶链式反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分离,结果在1.3kb处可见DNA条带,作为对照的软骨细胞未见此DNA条带。④转染后软骨细胞BMP7蛋白表达电泳检测结果:在十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上可见相对分子质量约为18000的电泳条带。⑤转染后软骨细胞BMP7蛋白表达的Westernblot检测结果:可见相对分子质量约为18000的特异性条带。⑥转染后软骨细胞蛋白表�
- 曲福军侯宜周余来刘丽玲颜炜群杨同书侯立中
- 关键词：生物医学工程骨形态发生蛋白质类软骨细胞
