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携带丙型肝炎病毒非结构蛋白3基因的重组腺病毒构建研究被引量：2: 2005年; 目的构建表达丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)的复制缺陷型重组腺病毒,为防治HCV感染的基因免疫和基因治疗提供实验基础。方法将HCV NS3基因定向克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上,经与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在大肠埃希菌BJ5183内同源重组后,转染293细胞进行包装,并反复感染293细胞进行扩增。结果通过PCR扩增、酶切、核酸测序及Western杂交法检测鉴定,均证实插入穿梭质粒中的片段为HCV NS3基因(基因型1b);所包装出的复制缺陷型重组腺病毒AdEasy-GFP-NS3具有良好的感染能力,并可在293细胞中表达HCV NS3蛋白。结论AdEasy-GFP-NS3携带有HCV NS3基因,能有效地感染293细胞并高效表达,从而为丙型肝炎基因疫苗的进一步研究奠定了基础。; 周陶友陈敏李卫华赵连三何芳刘丽唐红; 关键词：丙型肝炎病毒非结构蛋白3 重组腺病毒疫苗基因治疗

乙肝病毒核酸疫苗诱导BALB/c小鼠特异性免疫应答: 2008年; 目的观察含乙肝病毒(hepatitis Bvirus,HBV)preS2S基因的核酸疫苗免疫小鼠后的特异性免疫应答。方法将BALB/c小鼠随机分为4组分别肌肉接种pCMV-S2S、乙肝表面抗原(HBsAg)、空载质粒(pCMV)及生理盐水(NS)。免疫组织化学法检测接种局部组织preS2S抗原的表达,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测特异性CTL活性,ELISA法检测小鼠血清特异性抗体Anti-HBs。结果pCMV-S2S组小鼠肌肉细胞中有较多量的preS2S蛋白表达,其它小鼠肌肉细胞中均未检出preS2S蛋白表达。pCMV-S2S组小鼠CTL活性为(32.10±1.93)%,明显高于各对照组(P<0.05)。pCMV-S2S组小鼠8周后Anti-HBs阳性率最高为42.9%。HBsAg组小鼠4周时Anti-HBs阳性率即达到100%。pCMV组及NS组小鼠血清中均未检测出Anti-HBs。结论乙肝核酸疫苗pCMV-S2S能在小鼠体内表达preS2S蛋白,并能在小鼠体内诱生较强的特异性CTL活性,也能诱生一定程度的特异性体液免疫应答。; 何芳唐红刘丽刘聪赵连三; 关键词：核酸疫苗免疫应答

表达乙肝病毒preS2S蛋白的荷瘤小鼠模型的建立: 2008年; 目的:建立能表达乙肝病毒(hepatitis Bvirus,HBV)preS2S抗原蛋白的荷瘤小鼠模型,为研究HBV核酸疫苗的体内CTL应答及免疫治疗作用提供简便易行的研究模型。方法:以免疫印迹法验证SP2/0-S2S细胞中有HBVpreS2S抗原的稳定表达,将SP2/0-S2S细胞种植到BALB/c小鼠胁部皮下(荷瘤),观察能否生长成瘤,以及成瘤的时间、肿瘤大小和荷瘤后小鼠的生存时间;以免疫组织化学法检测小鼠肿瘤组织HBVpreS2S抗原的表达。以不表达preS2S抗原蛋白的SP2/0-CMV细胞荷瘤小鼠作为阴性对照。结果:荷瘤后3天～1周,SP2/0-S2S细胞可在小鼠皮下形成实体肿瘤,成瘤率为100%,肿瘤细胞中有preS2S抗原表达,荷瘤后小鼠的平均生存时间为16±1天;与不表达preS2S抗原蛋白的SP2/0-CMV细胞荷瘤小鼠相比,成瘤率、成瘤时间、肿瘤大小及生存时间差异。结论:建立了能表达HBVpreS2S抗原蛋白的荷瘤小鼠模型,可用于HBV核酸疫苗的体内CTL应答及免疫治疗作用的实验研究。同时也建立了不表达preS2S抗原蛋白的荷瘤小鼠模型,可用作阴性对照。; 何芳唐红刘丽刘聪赵连三; 关键词：乙型肝炎病毒 BALB/C小鼠

表达丙型肝炎病毒非结构蛋白3的重组腺病毒免疫小鼠的研究: 2007年; 目的构建表达HCV非结构蛋白3(NS3)的重组腺病毒RAd/NS3,探讨其免疫小鼠后诱导机体产生特异性免疫应答的能力。方法PCR扩增编码NS3蛋白(329～935位氨基酸)的基冈片段,定向克隆至重组腺病毒AdEasy-1系统的穿梭质粒pAdTrack-CMV上,与腺病毒基因组质粒pAdEasy-1共转化BJ5183菌,利用细菌内同源重组获得重组腺病毒质粒,转染293细胞,以包装、扩增重组腺病毒。将重组腺病毒以1×10~8 pfu剂量经皮下注射免疫BALB/c小鼠,并以100μg重组质粒pRC/ NS3经肌内注射途径免疫小鼠为对照。ELISA法检测免疫小鼠血清抗体水平,^(51)Cr释放法检测免疫小鼠细胞毒性T淋巴细胞体外杀伤功能。结果重组腺病毒经皮下免疫小鼠后可刺激机体产生较强的特异性体液免疫应答和细胞免疫应答,且免疫效果强于重组质粒pRC/NS3组,初次免疫后2周,前者20只小鼠抗-HCV全部阳转,而后者10只小鼠仅3只阳转.未观察到明显的不良反应。结论表达HCV NS3抗原的重组腺病毒载体疫苗能够诱导机体产生有效的体液和细胞免疫应答。; 李卫华赵连三周陶友何芳刘丽刘聪; 关键词：腺病毒科肝炎病毒

乙肝核酸疫苗对荷瘤小鼠免疫保护作用的实验研究: 2007年; 目的观察乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)核酸疫苗pCMV-S2S免疫小鼠后的特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答,及对表达HBV preS2S抗原的SP2/0-S2S肿瘤细胞攻击的保护作用。方法将BALB/c小鼠随机分为3组,于0、4及8周分别接种pCMV-S2S(实验组)、乙肝表面抗原蛋白疫苗(HBsAg,对照组1)、空载质粒(pCMV,对照组2)各3次。末次免疫后4周,每组各取3只小鼠,以乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测特异性CTL活性。各组其它小鼠均用于肿瘤细胞攻击实验:分别于一侧胁部皮下种植SP2/0-S2S细胞,同时于另一侧种植不表达HBV preS2S抗原的SP2/0-CMV细胞作阴性对照。种植肿瘤细胞(荷瘤)后观察成瘤时间、肿瘤大小和荷瘤后小鼠的生存时间及生存率。结果pCMV-S2S组CTL活性为(34.21±1.38)%,高于HBsAg组〔(19.64±1.50)%〕和pCMV组〔(3.45±1.89)%〕(P<0.05)。荷瘤后10d,pCMV-S2S组小鼠SP2/0-S2S细胞的成瘤率为58.3%,低于SP2/0-CMV细胞的成瘤率(91.7%)(P<0.05);两对照组SP2/0-S2S细胞与SP2/0-CMV细胞的的成瘤率无明显差异。荷瘤后pCMV-S2S组初次出现死亡小鼠的时间为24d,较两对照组均延迟了13d,平均生存时间为(31±1)d,较两对照组延长(P<0.05);4周生存率(75%)高于两对照组(P<0.05),两对照组之间生存时间及生存率差异无统计学意义。结论HBV核酸疫苗pCMV-S2S能在小鼠体内诱生较强的特异性CTL活性,对荷瘤小鼠具有特异性免疫保护作用,可望用于HBV感染的免疫保护。; 何芳唐红刘丽赵连三刘聪; 关键词：核酸疫苗细胞毒性T淋巴细胞免疫保护

表达丙型肝炎病毒NS3抗原的重组腺病毒构建及体外表达被引量：4: 2005年; 为探索研制丙型肝炎疫苗的新途径,以期获得防治丙型肝炎的重组腺病毒减毒活疫苗,我们构建了表达丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus ,HCV)非结构蛋白3(non structural protein 3,NS3)抗原的重组腺病毒RAd NS3,并检测其在体外表达。应用PCR从真核表达质粒pRC/NS3 中扩增编码HCV NS3 蛋白(329-935aa)的基因片段,定向克隆到重组腺病毒AdEasy-1系统的穿梭质粒pAdTrack CMV上,采用细菌内同源重组"两步转化法"构建携带HCV NS3基因的重组腺病毒基因组质粒pAd HCV NS3,转染293 细胞,成功包装出重组腺病毒RAd NS3,利用它有效地感染人肝癌细胞株HepG2,经RT PCR及免疫印迹等不同方法检测表明,被感染细胞能表达HCVNS3蛋白,为后续进行重组腺病毒在动物体内诱导抗HCV免疫应答能力的研究奠定了基础。; 李卫华赵连三周陶友何芳刘丽刘聪; 关键词：腺病毒丙型肝炎病毒 NS3 同源重组

乙肝核酸疫苗接种小鼠后特异性抗原表达及CTL应答的动态观察被引量：1: 2008年; 目的:观察乙肝病毒(hepatitis B virus,HBV)核酸疫苗pCMV-S2S免疫小鼠后,接种局部HBV preS2S抗原的表达及特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的动态变化。方法:将pCMV-S2S接种到BALB/c小鼠胫前肌,分别以免疫组化法检测接种局部肌肉HBV preS2S抗原表达的动态变化,乳酸脱氢酶(LDH)释放法检测特异性CTL活性的动态变化。结果:小鼠接种pCMV-S2S后,局部肌肉细胞3d后已有少量目的抗原HBV preS2S蛋白表达,4周时表达最强,至6月时仍可检出有preS2S蛋白表达,但表达强度明显减弱。小鼠接种pCMV-S2S3天后,特异性CTL活性平均值最高为21·67%,12周时CTL活性平均值最高为35·14%,6月时仍可检出较弱的CTL活性。结论:HBV核酸疫苗pCMV-S2S能在小鼠体内持续表达特异性抗原及诱生特异性CTL应答。; 何芳唐红刘丽刘聪赵连三; 关键词：乙型肝炎病毒核酸疫苗抗原表达细胞毒性T淋巴细胞

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国家高技术研究发展计划(2002AA214161)

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