内蒙古自治区自然科学基金(200607010405)
- 作品数：7 被引量：31H指数：4
- 相关作者：郭旭东旭日干毛舒燕宝明涛尹俊更多>>
- 相关机构：内蒙古大学内蒙古农业大学中国科学院广州生物医药与健康研究院更多>>
- 发文基金：内蒙古自治区自然科学基金国家高技术研究发展计划内蒙古自治区高等学校科学研究项目更多>>
- 相关领域：生物学农业科学更多>>
- 应用RNAi干扰eGFP转基因小鼠胎儿成纤维细胞中FGF5基因的表达
- 2008年
- 在小鼠FGF5基因干扰的研究中,针对小鼠FGF5mRNA的第316～335bp区域、第499～518bp区域和第766～785bp区域分别设计了发夹式RNA干扰片段,并将干扰片段连接到带有H1启动子的红色荧光表达载体上,将载体以脂质体法转染到eGFP转基因小鼠胎儿成纤维细胞中,搜集转染后的细胞提取总RNA,并反转录成cDNA。用SYBRGREENⅠ荧光定量PCR方法对转染了不同干扰载体的细胞cDNA进行检测,结果干扰载体对eGFP转基因小鼠成纤维细胞中的FGF5表达有较强的抑制作用。
- 宝明涛郭旭东旭日干
- 关键词：RNAISHRNASYBRFGF5
- IGF-1毛囊特异表达载体的构建以及转染绒山羊胎儿成纤维细胞的研究被引量：18
- 2009年
- 本研究旨在构建绵羊胰岛素样生长因子l(IGF-1)毛囊特异表达载体pCDsR-KI,并转染绒山羊胎儿成纤维细胞,最终获得稳定表达红色荧光并可用于核移植的转基因细胞克隆。通过RT-PCR方法获得IGF-1 cDNA,其与KAP6-1基因启动子片段以及红色荧光蛋白表达元件连接构成IGF-1毛囊特异表达载体pCDsR-KI(大小7.4 kb)。以组织块贴附法分离和培养绒山羊胎儿成纤维细胞,外源性表达载体以lipofectamineTM2000介导转染所培养的第2代成纤维细胞,在DMEM/F12+10%FBS、37℃、5%CO2中培养,并添加G418筛选,获得了表达红色荧光蛋白的细胞克隆。经PCR法鉴定证实外源基因已经整合在细胞基因组中。通过分析转基因体细胞的生长曲线和染色体核型证明转基因细胞的生长状态良好、各项参数趋于正常。为下一步通过体细胞核移植技术获得转基因克隆绒山羊准备了核供体细胞。
- 郭旭东尹俊杨东山毛舒燕宝明涛旭日干
- 关键词：绒山羊红色荧光蛋白胎儿成纤维细胞
- 毛囊特异表达载体pCDsR-UI的构建以及绒山羊胎儿成纤维细胞的体外转染和筛选被引量：1
- 2012年
- 构建IGF1基因的毛囊特异表达载体,可为今后通过体细胞核移植技术建立转基因克隆绒山羊准备核供体细胞.将绵羊IGF1cDNA序列,连接到含有UHS启动子序列的克隆载体p19TU的SalI、SphI位点,获得过渡质粒载体p19TUI;pCDsRed2和过渡质粒载体分别经酶切和连接构成表达载体pCDsR-UI.以组织块贴附法分离和培养绒山羊胎儿成纤维细胞,外源性表达载体以脂质体方法转染所培养的第2代成纤维细胞,DMEM/F12+10%FBS、37℃5%CO2中培养,经添加G418筛选,获得了稳定表达红色荧光蛋白的细胞克隆,经特异性PCR鉴定证实外源基因已经整合在细胞基因组中.转基因前后分析细胞生长曲线和染色体核型证明转基因细胞的生长状态良好、各项参数正常.
- 肖红高圆梁伟高笑宇汪慧杜晓媛郭旭东刘东军
- 关键词：绒山羊胰岛素样生长因子I红色荧光蛋白胎儿成纤维细胞
- 绒山羊表达红色荧光及转胰岛素样生长因子Ⅰ基因体细胞核移植胚胎的制备被引量：4
- 2008年
- 利用含有红色荧光和Neor基因双选择标记的IGF1毛囊特异表达载体pCDsR-KI转染绒山羊胎儿成纤维细胞,经G418筛选获得具有红色荧光的IGF1转基因细胞.核移植操作前,通过比较卵母细胞体外成熟培养不同时间的成熟率以及核与极体的距离,确定20h为绒山羊卵母细胞的最佳成熟时间.比较了不同激活方法和培养体系对孤雌胚激活效率和孤雌胚早期发育的影响,结果表明：IA23187＋6-DMAP组的激活效率和囊胚率（88.7%＆21.6%）均稍高于乙醇＋6-DMAP组（86.4%＆20.4%）,但二组相应数据之间差异均不显著（P〉0.05）,选择前者作为转基因核移植胚的激活方案;SOFaa和CR1aa两种体外培养体系中,孤雌胚卵裂率（86.8%vs83.9%）和囊胚率（23.1%vs17.2%）均差异不显著（P〉0.05）,选择结果较好的SOFaa组.比较了不同电融合参数的融合效果,结果表明：190V/mm处理组结果（62.4%）显著高于130V/mm（32.8%）和200V/mm（42.9%）组（P〈0.05）.通过T-SCNT获得转基因重构胚胎203枚,48h卵裂率为79.3%（161/203）,第7~9天囊胚发育率为15.3%（31/203）.所得到的31枚囊胚中,较强表达红色荧光蛋白的囊胚数为17枚（阳性率为54.8%）.随机挑选两枚红色荧光囊胚以PCR法进行鉴定,结果全部为转基因阳性.以上结果显示：（i）表达载体的红色荧光蛋白和Neor基因可以正常表达可获取转基因细胞和阳性转基因胚胎;（ii）所制备转基因囊胚仍有部分不表达红色荧光蛋白,说明即使选择转基因阳性细胞进行核移植所得囊胚也并非全部为转基因阳性,在囊胚期进一步筛选是必要的;（iii）通过TSCNT操作及优化,成功获得了表达红色荧光并同时转有IGF1基因的绒山羊胚胎,为绒山羊的转基因研究提供基础数据.
- 郭旭东杨东山奥旭东吴侠李光鹏王玲玲宝明涛雪莲旭日干
- 关键词：绒山羊毛囊胎儿成纤维细胞转基因体细胞核移植
- 绵羊角蛋白关联蛋白KAP6-1基因5′端调控区的分子克隆及测序结果比较被引量：11
- 2007年
- 根据绵羊毛囊角蛋白关联蛋白(KAP 6-1)基因已知DNA序列设计合成了两个特异性引物,以绵羊基因组DNA为模板,PCR扩增出1 042 bp的特异性片段,连接到pM D 19T载体中获得该片段克隆.经过快速提质粒法筛选、限制性内切酶分析表明该克隆包含所需的目的片段.DNA测序结果也证明该克隆片段与原基因5′端调控区序列相比具有很高的一致性.研究结果为今后制备转基因克隆动物,在毛囊细胞中特异性表达绒毛生长调控基因奠定了基础.
- 郭旭东毛舒燕宝明涛尹俊旭日干
- 小鼠超高硫角蛋白基因启动子的分子克隆及序列分析被引量：2
- 2007年
- 根据小鼠超高硫角蛋白(UHS)基因已知DNA序列设计合成了两个特异性引物,以小鼠全血提取的总DNA为模板,PCR扩增出688bp的特异性片段,连接到pMD19T载体中获得该片段克隆p19TU。经过快速提取质粒法筛选、限制性内切酶分析证明该克隆就是UHS基因5'端的调控区序列。序列分析结果也表明该克隆片段与原基因调控序列相比具有很高的一致性。研究结果为今后制备转基因克隆动物、在毛囊细胞中特异性表达绒毛生长调控基因奠定了基础。
- 郭旭东侯冬霞毛舒燕旭日干
- 关键词：调控区PCR
- 一种快速提取质粒DNA用于鉴别重组克隆的方法被引量：4
- 2007年
- 介绍了一种利用过夜培养的菌液瞬时提取质粒DNA，并用于电泳鉴别含有插入子克隆的方法。事先无需准备许多繁琐的相关试剂，提取质粒的全过程只需3～5min就可完成，非常适合于做重组克隆的快速鉴别。
- 郭旭东毛舒燕侯冬霞旭日干
- 关键词：质粒DNA重组克隆
