国家自然科学基金(30170893)
- 作品数：29 被引量：50H指数：4
- 相关作者：高美华王秋波任书荣张艳丽张丽更多>>
- 相关机构：青岛大学青岛市市立医院中国海洋大学更多>>
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- 藻蓝蛋白对Hela细胞CD59基因表达调控作用的研究被引量：7
- 2006年
- 探讨了钝顶螺旋藻藻蓝蛋白（PC）对Hela细胞CD59基因表达的调控作用。以正常人CD59cDNA基因为模板，经PCR扩增后重组入真核表达质粒载体pALTER-MAX，然后利用阳离子脂质体（Lipfectamine-2000）将重组质粒和PcDNA共转染人子宫颈癌细胞（Hela）和对照用正常中国仓鼠卵巢细胞（Chinese hamster ovary，CHO）进行表达。用不同浓度的钝顶螺旋藻藻蓝蛋白作用于转染细胞，通过核酸分子杂交技术、免疫荧光标记法和ELISA法对细胞中CD59分子的表达进行检测。结果表明：成功构建了重组质粒pALTER-MAX．CD59，并将其导入真核细胞（Hela，CHO），经CAl8筛选获得了CD59分子高效表达的细胞克隆。用藻蓝蛋白作用于筛选出的转基因细胞，证实藻蓝蛋白可促进Hela细胞表面CD59蛋白的表达并抑制Hela细胞的增殖，而对于正常CHO细胞无明显作用。
- 李冰张学成高美华褚现明
- 关键词：藻蓝蛋白CD59HELACHO
- 人CD59基因的突变和表达及其活性研究被引量：10
- 2005年
- 目的: 构建人突变CD59(hmCD59)基因的真核表达系统, 深入研究hmCD59在糖尿病血管并发症中的作用。方法: 分别构建两种含有hmCD59全长cDNA序列的重组pALTER质粒, 运用脂质体介导法, 与pcDNA3质粒共转染CHO细胞, 以G418筛选阳性克隆(编号为hmCD59- 1- CHO及hmCD59 -2- CHO)。应用荧光抗体技术、免疫酶联技术及Westernblot, 进一步检测hmCD59蛋白在转染细胞膜表面的表达。通过双羧乙基碳氧荧光素四乙酰氧甲酯 (BCECF/AM)荧光染料释放试验, 对hmCD59蛋白糖基化前后的抗补体活性进行检测。结果: 筛选出的阳性克隆细胞用荧光抗体技术免疫酶联技术检测表明, 在细胞膜表面有hmCD59分子表达。将细胞的裂解物进行Westernblot证实, 在其相对分子质量(Mr)为 20 000处可见 1条与CD59的Mr相当的蛋白带。BCECF/AM荧光染料释放试验提示, 两种突变质粒的表达产物均具有抗补体活性, 糖基化后活性减弱。结论: 获得两株可稳定表达hmCD59的细胞。表达的hmCD59具有抗补体活性, 但糖基化后活性减弱。
- 张艳丽高美华
- 关键词：真核表达中国仓鼠卵巢细胞抗补体活性
- 人突变CD59基因在CHO细胞的表达、检测及生物活性研究被引量：3
- 2007年
- 目的:分别构建两个高效表达人突变CD59的CHO细胞真核表达系统,探讨突变CD59基因表达蛋白糖基化前后抗补体活性的变化,为在基因水平阐明糖尿病血管增殖症的发病机理奠定基础。方法:将两种含不同突变基因的人CD59全长cDNA序列(HM7、HM8)的重组pALTER质粒运用阳离子脂质体导入法共转染CHO细胞,用含有400μg/ml新霉素类似物(G418)的F12培养基筛选出阳性表达克隆,应用荧光免疫组化(FIH)检测CD59在CHO细胞表面的表达。经染料释放试验检测突变CD59糖基化前后抗补体活性。结果:运用阳离子脂质体导入法将重组pALTER质粒与pcDNA3质粒共转染CHO,成功筛选出的阳性克隆经FIH证明突变CD59可在CHO细胞表达。染料释放法证实两种突变CD59均具有抗补体活性,且在高糖环境下易糖基化,糖基化后抗补体活性明显降低。结论:建立了两个高效表达突变CD59的真核表达系统,获得阳性克隆细胞株。初步研究证实突变CD59具有抗补体活性,糖基化后抗补体活性明显降低,为单克隆抗体的制备奠定了基础。
- 吴宁高美华
- 关键词：真核表达系统CHO细胞细胞转染抗补体活性
- 突变型CD59蛋白对卵巢癌细胞的抑瘤效应
- 2009年
- 背景与目的:国外报道已在多种实体肿瘤细胞中发现有CD59分子的过表达,并与肿瘤的失控性生长和恶性转化密切相关。本研究探讨突变型CD59在卵巢癌细胞A2780表面的抗补体活性以及与LPS联合抑制A2780细胞增殖的活性。方法:取突变型CD59质粒、野生型CD59质粒分别转染A2780细胞,G418筛选稳定表达细胞克隆,并从基因水平和蛋白水平鉴定CD59突变基因和野生型基因的转染情况。MTT法观察野生型CD59与突变型CD59在A2780细胞表面的抗补体活性,以及突变型CD59在LPS存在时对细胞的抑瘤效应。结果:通过荧光免疫检测、流式细胞术分析、RT-PCR鉴定证明建立了稳定转染野生型和突变型CD59的A2780细胞。MTT结果显示,与野生型CD59相比,突变型CD59失去对补体的抑制功能,与对照组未转染的A2780细胞相比无显著性差异。MTT检测5μg/mLLPS作用30min,对转染野生型CD59、突变型CD59及未转染A2780细胞的增殖抑制率分别为(26.9±2.95)%、(36.3±4.87)%、(29.6±3.16)%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:CD59的W40位点对其功能具有重要作用,封闭该位点能够提高补体溶细胞作用,并有助于LPS发挥抑制瘤细胞增殖活性,有望应用于肿瘤治疗。
- 李健敏高美华张蓓
- 关键词：CD59补体A2780细胞
- 来氟米特对小鼠CD4^+CD25^+调节性T细胞的影响被引量：3
- 2008年
- 目的:评价新型免疫抑制剂来氟米特应用对CD4+CD25+调节性T淋巴细胞的影响。方法:以灌胃的方式给予正常BALB/c小鼠来氟米特或对照溶剂4周,流式细胞仪分析不同淋巴器官内T淋巴细胞亚群,包括CD4+CD25+调节性T细胞数量及比例的变化。结果:与对照溶剂组相比,LEF组小鼠脾、肠系膜淋巴结内CD4+T淋巴细胞和CD4+CD25+调节性T细胞比例均明显下降,外周淋巴结和胸腺没有明显变化;但胸腺内CD4+CD25+调节性T细胞/CD4单阳性胸腺细胞的比例明显增加。结论:来氟米特对中枢和周围淋巴器官内CD4+CD25+调节性T细胞的影响不同。胸腺内CD4+CD25+调节性T细胞对来氟米特的作用与CD4单阳性胸腺细胞相比具有较强的抗性;而脾及淋巴结的CD4+CD25+调节性T细胞对来氟米特的反应与非调节性T细胞相似。
- 伊焕发甄昱张连军赵勇
- 关键词：来氟米特调节性T细胞免疫抑制
- CD59结合短肽对补体介导的前列腺癌细胞溶解影响
- 2009年
- 目的观察CD59结合短肽（sp22）对补体介导高表达人CD59分子的PC-3细胞溶解的影响。方法利用脂质体法将携带人野生型CD59基因的pIRES质粒（wCD59-pIRES）转染PC-3细胞,G418筛选稳定转染的细胞株,荧光免疫组化技术检测细胞表面CD59分子的表达,补体溶解试验观察sp22和抗CD59单克隆抗体对补体介导的高表达CD59分子的PC-3细胞溶解的影响。结果高表达CD59分子的PC-3细胞株构建成功;与对照组比较,sp22组转染细胞的溶解率显著升高（F=719.552,q=12.181-79.942,P〈0.05）;相同浓度条件下,sp22组转染细胞的溶解率明显高于抗CD59单克隆抗体组（q=7.805-12.280,P〈0.05）。结论sp22可封闭PC-3细胞表面高表达CD59分子的补体结合位点,显著增强抗PC-3细胞抗体所诱发的补体介导的抗瘤作用。
- 解西河高美华张蓓
- 关键词：短肽前列腺肿瘤
- CD59配体肽基因对卵巢癌细胞CD59表达的影响被引量：1
- 2010年
- 目的研究CD59配体肽基因对卵巢癌细胞CD59表达的影响。方法构建CD59配体肽基因的真核表达重组体(CD59配体-pIRES),转染人卵巢癌细胞A2780,G418筛选稳定表达细胞克隆;RT-PCR及Westernblot方法检测细胞表面CD59 mRNA及蛋白的表达;MTT法测定细胞增殖抑制率。结果成功构建了CD59配体肽基因真核表达重组体,转染后的A2780 CD59 mRNA及蛋白的表达水平与WT-A2780比较均明显下降(t=9.217、.20,P<0.05);细胞增殖抑制率明显增高(F=5.417,q=3.93,P<0.05)。结论CD59配体肽基因可影响人卵巢癌细胞A2780表面CD59的表达,有望用于肿瘤治疗。
- 李伟伟高美华张蓓解西河
- 关键词：A2780细胞重组融合蛋白质类
- 人突变CD59基因在卵巢癌细胞表达及其生物活性检测
- 2009年
- 目的研究野生型CD59与突变型CD59在卵巢癌细胞A2780表面的抗补体活性。方法取突变型CD59质粒、野生型CD59质粒分别转染A2780细胞,G418筛选稳定表达细胞克隆;酶免疫法及RT-PCR方法检测细胞表面CD59蛋白及mRNA的表达;制备抗CD59多克隆抗体,MTT法观察CD59蛋白的抗补体活性。结果野生型及突变型CD59质粒扩增成功,并成功建立了稳定转染野生型和突变型CD59的A2780细胞株;与野生型CD59相比,突变型CD59失去对补体的抑制功能,与未转染A2780表面CD59表达无显著差异。结论CD59的W40位点对其功能具有重要作用,封闭该位点能够提高补体溶细胞作用,有望应用于肿瘤治疗。
- 李健敏高美华张蓓
- 关键词：卵巢肿瘤突变
- CD59配体肽真核表达系统的构建及对PC-3细胞活性的作用研究被引量：1
- 2010年
- 目的:构建CD59分子配体肽sp22基因重组真核表达系统,探讨sp22基因对CD59分子的影响。方法:构建含特异性sp22基因的真核重组表达载体sp-pIRES,脂质体法转染人前列腺癌PC-3细胞,G418筛选建立稳定转染细胞系,RT-PCR检测转染细胞中sp22基因mRNA的表达筛选阳性细胞克隆,Western blot、ELISA竞争抑制试验检测转染细胞CD59蛋白的表达;台盼蓝染色实验和LDH实验测sp22基因对CD59分子功能的影响。结果:PCR、酶切及DNA测序鉴定表明成功构建了sp-PIRES重组表达载体;RT-PCR试验证实sp22在spPC-3细胞中成功表达;Westernblot、ELESA竞争抑制试验表明:spPC-3细胞比正常PC-3细胞CD59蛋白表达减少(P<0.05);与正常PC-3细胞相比,补体对spPC-3细胞的溶解杀伤明显增强(P<0.05)。结论:sp22基因可在mR-NA及蛋白水平影响人前列腺癌PC-3细胞表面CD59抗原的表达及功能,降低CD59分子抗补体活性,有望用于肿瘤治疗。
- 李伟伟高美华张蓓解西河
- 关键词：CD59PC-3细胞补体
- 突变人CD59基因在真核细胞中的表达活性被引量：4
- 2005年
- 目的构建突变人CD59的真核表达系统,检测突变人CD59蛋白糖化前后抗补体活性,探讨CD59在糖尿病血管并发症病理机制中的重要作用,为人类糖尿病血管增殖症的发病机理提供依据。方法应用阳离子脂质体法将含有突变人CD59的重组pALTER质粒与pCDNA共转染入CHO细胞;G418筛选出阳性克隆,流式细胞术进一步筛选出高表达克隆;免疫组化、免疫荧光、Western-blot、ELISA验证CD59的表达;BCECF释放试验研究糖化前后突变人CD59抗补体活性。结果成功构建突变人CD59的真核细胞表达系统;糖化后较糖化前突变人CD59转染CHO细胞BCECF释放率明显升高。结论高糖使CD59活性下降,可能导致或加速糖尿病血管并发症的发生。
- 张丽高美华
- 关键词：CD59中国仓鼠卵巢细胞补体
