中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(BRF080303)
- 作品数：7 被引量：21H指数：3
- 相关作者：李文卉盖文燕姚菊霞付宝权贾万忠更多>>
- 相关机构：中国农业科学院兰州兽医研究所甘肃农业大学更多>>
- 发文基金：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项国家科技支撑计划政府间科技合作项目更多>>
- 相关领域：农业科学生物学医药卫生更多>>
- 多头带绦虫脑多头蚴cDNA表达文库的构建及初步分析被引量：2
- 2011年
- 从甘肃景泰羊源脑多头蚴原头节提取总RNA，以Oligo（dT）纤维素柱纯化mRNA，利用LambdaZAPIIXR文库构建试剂盒构建了脑多头蚴eDNA表达文库。从构建的原始文库随机挑选单个噬菌斑进行PCR，确定文库重组率和插入外源基因片段大小，鉴定文库质量。结果表明脑多头蚴eDNA表达文库的原始库容量为1．0×10。pfu，扩增后文库滴度为1．6×10^9pfu／mL。随机挑选的165个噬菌斑克隆中，0．25kb以上的克隆155个，重组率为93．9％，对其中0．5kb以上的115个克隆测序共获得104个表达序列标签（EST），分析后得到96个单一EST序列（UniqueEST），其中20个EST与绦虫基因有同源性，38个EST与吸虫基因有同源性，4个EST与线虫基因有同源性，17个EST与其他物种有同源性，其余17个EST没有同源基因。这些EST编码的氨基酸序列有多头带绦虫六钩蚴Tml6抗原、猪带绦虫副肌球蛋白、猪带绦虫免疫原蛋白Ts76等绦虫抗原的同源蛋白以及烯醇化酶等一些酶类、热休克蛋白、肌动蛋白、核糖体蛋白等同源蛋白。
- 李文卉王建魁盖文燕姚菊霞曲自刚贾万忠罗建勋RaduBlaga付宝权
- 关键词：脑多头蚴CDNA表达文库表达序列标签
- 多头带绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶基因的克隆及序列分析被引量：1
- 2011年
- 从自然感染的羊脑内采集脑多头蚴原头节,提取总RNA。根据亚洲牛带绦虫的TaHc2-D11 mRNA序列设计特异引物,采用RT-PCR技术扩增多头带绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶(TmTPx)基因。PCR产物连接到pMD18-T载体构建重组质粒pMD-TmTPx,转化大肠埃希菌DH5α后筛选阳性克隆,经限制性酶切及测序鉴定后进行序列分析。扩增获得大小为614bp的TmTPx基因cDNA,该基因的完整开放阅读框架(ORF,591bp)编码196个氨基酸,编码蛋白的相对分子质量为Mr 21690,等电点为7.61。生物信息学分析结果表明TmTPx具有一个典型的2-Cys Prx保守功能结构域。绦虫已知TPx的分子进化分析发现,多头带绦虫与亚洲牛带绦虫的亲缘关系最近,与猪带绦虫和肥头绦虫的亲缘关系次之,与细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的亲缘关系最远。
- 李永光李文卉盖文燕姚菊霞曲自刚贾万忠Radu Blaga付宝权
- 关键词：脑多头蚴克隆
- 多头带绦虫Tm16与Tm18抗原基因的克隆及原核表达被引量：1
- 2011年
- 为原核表达Tm16和Tm18重组蛋白,本研究以自然感染羊源脑多头蚴原头节基因组DNA为模板分别扩增Tm16和Tm18抗原基因全基因片段,测序鉴定后合成其开放阅读框架DNA片段,将基因组序列中的内含子去除并对其稀有密码子进行改造优化,构建重组表达质粒pGEX-Tm16和pGEX-Tm18。转化大肠杆菌BL21后以IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析表达产物并进行纯化。结果显示:在大肠杆菌中表达出带有GST标签的大小约为39.6 ku和39.4 ku的重组蛋白,经谷胱甘肽琼脂糖树脂纯化得到高纯度的可溶性的GST-Tm16及GST-Tm18重组蛋白,western blot分析表明重组蛋白均能够被兔抗GST单克隆抗体特异性识别。
- 李文卉盖文燕姚菊霞曲自刚贾万忠罗建勋BLAGA R付宝权
- 关键词：原核表达
- 多头带绦虫甘肃分离株分子COⅠ基因部分序列比较分析被引量：6
- 2010年
- 应用线粒体DNA中的细胞色素c氧化酶亚基I（COI）基因作为分子标记,对我国甘肃省景泰和平凉地区10个绵羊源脑多头蚴进行分析,与已知带属绦虫种的相应序列进行相似性比较,下载GenBank数据库的带属绦虫COI基因片段序列构建系统进化树,分析其分类及亲缘关系.结果表明,所有多头带绦虫分离株均成功扩增出444 bp的COI基因片段,去除引物序列后多头带绦虫分离株的COI基因片段为396 bp,可以分为4类,共有5个核苷酸变异位点,变异率为0.25%～1.26%.基于COI核苷酸序列的系统进化树表明所有T.multiceps分离株构成一个分支,可分为2个亚群.T.multiceps与T.krabbei 的亲缘关系最近,其次为T.serialis,T.asiatica,T.saginata,与T.ovis等其他带属绦虫关系较远,与T.mustelae关系最远.COI基因序列在种内相对保守,又存在一定的种间差异,可作为带属绦虫分类鉴定研究的分子标记.
- 李文卉盖文燕姚菊霞曲自刚贾万忠罗建勋R. Blaga付宝权
- 关键词：脑多头蚴COI系统进化
- 吕氏泰勒虫cDNA表达文库的构建及其抗原基因的免疫筛选被引量：5
- 2009年
- 【目的】构建吕氏泰勒虫裂殖子cDNA表达文库,并从中筛选抗原候选基因。【方法】从吕氏泰勒虫裂殖子直接提取和纯化mRNA,采用oligo(dT)引物合成双链cDNA,并在其两端加EcoRⅠ/HindⅢ定向接头。将所产生的cDNA分子定向克隆到具有EcoRⅠ/HindⅢ粘性末端的λSCREEN载体的两臂之间。用PhageMaker extract对连接产物进行体外包装以形成完整的噬菌体,并用之转染大肠杆菌ER1647,从而构建成吕氏泰勒虫的cDNA表达文库。用吕氏泰勒虫阳性血清和兔抗绵羊IgG-AP筛选得到阳性克隆,经测序和Blast软件分析并获得新基因。【结果】成功构建吕氏泰勒虫裂殖子cDNA表达文库,其初级库容量约为1.0×106PFU,扩增文库的滴度为8.2×108PFU·ml-1,文库重组率为100%;通过免疫学筛选、测序和Blast软件分析,共获得30个新基因,其中15个基因已登录GenBank/NCBI。【结论】为研究泰勒虫疫苗、新型医药和诊断抗原,以及发展可持续性防制羊泰勒虫病提供基本材料。
- 李有全罗建勋高金亮关贵全马米玲刘志杰刘军龙刘爱红任巧云党志胜鲁炳义刘光远白启殷宏
- 关键词：CDNA表达文库免疫筛选
- 多头带绦虫甘肃分离株线粒体NADH脱氢酶亚基Ⅰ基因片段差异分析被引量：3
- 2011年
- 应用线粒体DNA中的NADH脱氢酶亚基Ⅰ（ND1）基因作为分子标记,对我国甘肃省景泰和平凉地区10个绵羊源脑多头蚴进行分析,构建系统进化树,分析其种内变异。结果表明,所有多头带绦虫（T.multiceps）分离株均成功扩增出约0.5 kb的ND1基因片段。序列分析显示,去除引物序列后多头带绦虫的ND1基因片段长为488bp,可以分为9类,共有22个核苷酸变异位点,变异率为0.20%~2.66%。基于ND1序列的系统进化树表明所有T.multiceps分离株构成1个分支,可分为3个亚群,国内分离株分别处在不同的亚群中。国内分离株中除了与已知的遗传变异型Tm1（AY669089/Tm-JT081204/Tm-JT090331）和Tm3（DQ077820/Tm-JT080526）相同外,还存在新的遗传变异型（Tm-JT081008/Tm-JT090603/Tm-JT090115-2）,独立为一支,与其他分离株亲缘关系较远;表明ND1基因片段适合作为研究T.multiceps分离株种内变异的分子标记。
- 李文卉盖文燕姚菊霞曲自刚贾万忠罗建勋R.Blaga付宝权
- 关键词：脑多头蚴种内变异
- 多头带绦虫TPx基因片段的克隆及原核表达被引量：4
- 2009年
- 从自然感染的病羊脑内采集多头蚴原头节,提取总RNA,采用RT-PCR技术扩增多头带绦虫硫氧还蛋白过氧化物酶(TmTPx)基因片段,PCR产物连接到pMD18-T载体,转化至大肠杆菌DH5α后测序,发现克隆到的TmTPx基因片段开放阅读框为453 bp,编码150个氨基酸。对TmTPx基因片段进行限制性酶切后连接到表达载体pGEX-4T-1,构建重组表达质粒pGEX-4T-TmTPx,转化大肠杆菌DH5α后筛选阳性克隆,经限制性酶切分析、PCR及测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21,以IPTG进行诱导表达,用SDS-PAGE分析表达产物。结果显示,成功表达了大小约为43 ku的融合蛋白。对表达产物纯化后免疫家兔,采集血清用ELISA测定抗体效价,发现兔抗TmTPx重组蛋白的抗体能够与多头蚴原头节抗原发生特异性反应,说明该重组蛋白具有较好的免疫原性。
- 李永光李文卉李航盖文燕王鸿盛姚菊霞王艳华张德林贾万忠Radu Blaga付宝权
- 关键词：多头蚴重组蛋白免疫原性
