国家自然科学基金(30370587)
- 作品数：29 被引量：66H指数：5
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- 不同剂量HIF-1α基因对兔缺血后肢血管生成作用的影响被引量：2
- 2010年
- 目的研究不同剂量腺病毒介导的低氧诱导因子-1α(HIF-1α)基因对兔缺血后肢血管新生的影响。方法45只新西兰大白兔建立急性左后肢缺血模型,随机分成5组,每组9只,分别在术后即刻肌肉注射生理盐水0.5ml(NS组)、腺病毒空载体2×1010 PFU(Ad-null组)、腺病毒介导的HIF-1α2×109 PFU(低剂量组)、2×1010 PFU(中剂量组)、2×1011 PFU(高剂量组)。术后第7天行实时PCR检测骨骼肌中HIF-1α mRNA表达水平,术后第0、14、28天对兔后肢进行对比超声检查,术后第28天行病理切片CD31免疫组化微血管密度计数。结果实时PCR显示NS组和Ad-null组HIF-1α基因在mRNA水平表达量相当(P>0.05);各基因转染组HIF-1α表达量高于NS组和Ad-null组,且随转染剂量增加而增加,组间比较差异有统计学意义(P<0.01);对比超声示NS组和Ad-null组A×β标化值无明显差别(P>0.05)。HIF-1α各转染组A×β标化值随剂量增加而增大(高剂量组与NS组、Ad-null组比较,P<0.01;其余各组间比较,P<0.05);微血管密度值各组间比较亦呈上述规律。结论腺病毒介导的HIF-1α基因能促进急性缺血肢体的血管生成,其效果随剂量增加而增大。
- 李明琰陈建威张新建陈冬冬裴静娴王月刚吴平生
- 关键词：低氧诱导因子-1Α缺血后肢血管生成实时PCR
- 携EGFP的人低氧诱导因子-1α真核表达载体的构建及表达被引量：1
- 2007年
- 目的构建携EGFP的人低氧诱导因子(HIF-1α)真核表达载体,为研究人HIF-1α基因对冠心病的血管新生作用奠定基础。方法采用分子克隆技术,KpnⅠ、XbaⅠ双酶切pcDNA3.1/V5-HisA-HIF-1α获得HIF-1αcDNA,克隆到质粒pcDNA3.1(+),得到质粒pcDNA3.1(+)-HIF-1α,以KpnⅠ,ApaⅠ双酶切质粒pcDNA3.1(+)-HIF-1α获得HIF-1αcDNA,克隆到质粒pEGFP-c1得到pEGFP-HIF-1α-c1质粒。脂质体法转染HEK293细胞,用荧光显微镜和Western blotting检测EGFP和HIF-1α在HEK293细胞的表达。均显示融合蛋白在细胞中表达。结果经酶切鉴定及PCR证实重组pEGFP-HIF-1α-c1质粒构建成功,荧光显微镜和Western blotting显示EGFP和HIF-1α融合蛋白在HEK293细胞中表达。结论成功构建重组真核表达载体pEGFP-HIF-1α-c1并在HEK293细胞表达,为冠心病的HIF-1基因治疗研究奠定更直观的基础。
- 谢宜军吴平生王月刚胡英芳童锴
- 关键词：低氧诱导因子-1Α绿色荧光蛋白真核表达载体基因治疗
- 对比超声对低氧诱导因子-1α促兔缺血后肢血管新生的评价
- 2010年
- 目的探讨应用对比超声(contrast enhanced ultrasound,CEU)评价低氧诱导因子-1α(hypoxia-in-ducible factor-1α,HIF-1α)促兔急性缺血后肢血管新生作用的可行性。方法18只新西兰大白兔高位节扎、离断左侧股动脉及其分支建立急性后肢缺血模型,随机分成3组,生理盐水组(NS组,术后即刻肌肉注射生理盐水0.5mL)、腺病毒空载体组(Ad-blank组,腺病毒空载体2×1010PFU溶于0.5mL生理盐水中肌肉注射)、腺病毒HIF-1α组(Ad-HIF-1α组,腺病毒介导的HIF-1α2×1010PFU溶于0.5mL生理盐水中肌肉注射),每组6只。各组术后即刻及术后14d、28d对兔后肢进行CEU及彩色多普勒血流显像(colordoppler flow imaging,CDFI)检查,第28天处死动物行病理切片行CD31免疫组化染色。结果CEU与CDFI、免疫组化检查结果一致,均显示:Ad-HIF-1α组缺血后肢血管新生优于NS组和Ad-Blank组(P<0.05);CEU与CDFI检查结果相关性良好(r=0.789,P=0.000),术后28dCEU与免疫组化微血管密度所得结果相关性良好(r=0.866,P=0.000)。结论CEU检查可对兔缺血后肢血流灌注进行定量分析,反映血管新生情况,与CDFI、免疫组化检查结论一致,相关性良好。
- 李明琰陈建威张新建崔凯谢佳佳陶宇吴平生
- 关键词：对比超声血流灌注血管新生
- 腺病毒介导的人低氧诱导因子–1α治疗兔后肢缺血的安全性研究被引量：2
- 2010年
- 目的:对腺病毒介导的人低氧诱导因子-1α(Ad-HIF-1α)治疗兔急性后肢缺血的安全性进行探讨。方法:(1)Ad-HIF-1α及腺病毒空载体(Ad-Blank)扩增、滴度测定。(2)建立兔急性后肢缺血模型,随机分为3组,每组6只,分别以Ad-HIF-1α(2.0×1010PFU)、Ad-Blank(2.0×1010PFU)和NS(0.5mL)肌注离断股动脉肌群,观察兔一般反应,术前及术后7、28d检查心电图和血常规、肝肾功能,术后28d处死动物行病理学检查。结果:(1)Ad-HIF-1α及Ad-Blank滴度分别达2.0×1013、1.5×1013Pfu/mL。(2)受试期兔一般情况好;3组兔血常规、肝肾功能指标在正常值范围,组间对比无显著差异(P>0.05);心电图正常;病理学检查未见癌细胞。结论:兔急性后肢缺血模型局部一次性转染2.0×1010PFU的Ad-HIF-1α,未见明显毒副反应;Ad-HIF-1α应用于兔是相对安全的。
- 陈建威李明琰陈冬冬裴静娴王月刚吴平生
- 关键词：缺血基因治疗腺病毒载体低氧诱导因子-1Α
- 人3突变型低氧诱导因子1α真核表达载体和腺病毒表达载体的构建及鉴定被引量：9
- 2008年
- 目的为了深入研究人低氧诱导因子1α基因对冠心病的血管新生作用,构建人3突变型低氧诱导因子1α腺病毒表达载体(pAdeno-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803)。方法双酶切pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564、pShuttle2-HIF-1α-Ala564-Ala803,凝胶回收前者酶切片段中大小为300bp的小片段及后者酶切片段中大小为6300bp的大片段,并将两者连接,重组成3突变型穿梭质粒pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803,并进行酶切和PCR鉴定。鉴定正确后,采用分子克隆技术,以PI-SceI和I-CeuI双酶切重组3突变型穿梭载体,获得含有3突变型HIF-1α(pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803)的表达盒,通过体外连接法与线性化的腺病毒骨架载体Adeno-XTM Viral DNA连接,重组成3突变型腺病毒载体(pAdeno-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803),再进行酶切及测序鉴定。结果经酶切鉴定及基因测序证实重组3突变型真核表达载体和腺病毒表达载体质粒构建成功。结论成功构建重组人3突变型低氧诱导因子1α真核表达载体(pShuttle2-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803)和人3突变型低氧诱导因子1α腺病毒表达载体(pAdeno-HIF-1α-Ala402-Ala564-Ala803)。
- 赖艳娴刘城王月刚谢宜军童锴胡英芳韦莉莉吴平生
- 关键词：低氧诱导因子-1Α血管新生
- 腺病毒介导突变体HIF-1α基因对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响被引量：4
- 2007年
- 目的观察突变体HIF-1α基因在体外培养的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)内的表达以及对其增殖的影响。方法以LacZ为对照,用野生型HIF-1α、单突变体HIF-1α564和双突变体HIF-1α564+803转染体外培养的大鼠VSMCs,Western blot测定HIF-1α蛋白表达:MTS/PES法确定大鼠VSMCs的增殖状态。结果Western blot结果显示以LacZ组的密度扫描结果为1,HIF-1α564(3.284±0.582),HIF-1α564+803(4.026±0.445)与野生型HIF-1α(2.429±0.765)相比差异有显著性(P<0.05),HIF-1α564与HIF-1α564+803组之间差异无显著性(P>0.05)。MTS/PMS比色结果显示:转染的第1天HIF-1α(0.242±0.020),HIF-1α564(0.234±0.021),HIF-1α564+803(0.223±0.020)3组均可抑制VSMCs增殖,与对照LacZ组(0.256±0.020)相比差异有显著性(P<0.05),但是各组间差异无显著性(P>0.05)。转染第3,5,7天HIF-1α564,HIF-1α564+803组较HIF-1α组相比,差异有显著性(P<0.05),尤以HIF-1α564+803组抑制大鼠VSMCs增殖能力最显著(P<0.05)。第7天HIF-1α564+803组Hoechst33258与TUNEL双重荧光染色提示大鼠VSMCs发生了凋亡。结论腺病毒介导的突变体HIF-1α基因能抑制大鼠VSMCs的增殖,突变体较野生型HIF-1α抑制作用更强,且双突变体HIF-1α564+803能诱导大鼠VSMCs发生凋亡。
- 刘城吴平生郭寿贵王月刚谢宜军
- 关键词：低氧诱导因子-1Α血管平滑肌细胞增殖基因治疗
- 携EGFP的人低氧诱导因子-1α腺病毒载体的构建及鉴定
- 目的构建携EGFP的人低氧诱导因子(HIF-1α)腺病毒表达载体,为研究人HIFlα基因对冠心病的血管新生作用奠定基础。方法采用分子克隆技术,以Kpnl,Apal双酶切pcDNA3．1(+)-HIF—1α质粒获得 HIF...
- 谢宜军王月刚郭寿贵童凯吴平生
- 文献传递
- 冻干重组人三突变型低氧诱导因子-1α腺病毒的制备
- 2011年
- 目的:研制冻干重组人三突变型低氧诱导因子-1α(HIF-1α)腺病毒。方法:将重组人三突变型HIF-1α腺病毒与不同配比的保护剂按适当比例混合,进行冻干,根据冻干后外观、病毒滴度测定、热稳定性试验、PCR、基因测序等结果,筛选冻干保护剂并评价冻干品质量。结果:冻干腺病毒所携带的目的基因信息无丢失或变异;以10%海藻糖、0.5%明胶、3%山梨醇等成分配制的保护剂作用较好,冻干后腺病毒感染性滴度下降0.33LgPFU/mL;37℃放置3周,滴度下降0.8LgPFU/mL。结论:以合适的保护剂制备冻干重组人三突变型HIF-1α腺病毒能达到较满意的效果。
- 陶宇杨丽魏旋李明琰陈建威吴平生
- 关键词：缺氧诱导因子1重组腺病毒冷冻干燥
- 人突变型低氧诱导因子1α腺病毒载体的构建及鉴定被引量：4
- 2005年
- 目的:构建人突变型低氧诱导因子1(H IF-1)α腺病毒表达载体,研究人突变型HIF-1α基因对冠心病的血管新生作用.方法:采用分子克隆技术,由pcDNA3.1(+)-HIF1α(突变型)质粒获得突变型HIF1αcDNA,克隆到穿梭质粒pShuttle2,以PI-SceI和I-CeuI双酶切重组穿梭质粒,获得含有突变型HIF1αcDNA的表达盒,通过体外连接法与线性化的腺病毒骨架质粒Adeno-X Viral DNA连接,重组成pAdeno-HIF1α腺病毒质粒,经酶切及测序鉴定正确后,在HEK293细胞中包装成为重组Adeno-HIF1α腺病毒,并进行PCR鉴定及滴度测定.结果:经酶切鉴定及基因测序证实重组腺病毒质粒构建成功,包装后冻融细胞的上清PCR检测重组腺病毒包装成功,病毒滴度为2×1012pfu/L.结论:成功构建重组腺病毒Adeno-HIF1α(突变型),为冠心病的突变型HIF1α基因治疗研究奠定基础.
- 郭寿贵吴平生王月刚傅锐斌
- 关键词：低氧诱导因子1Α突变腺病毒基因治疗
- 携EGFP的人低氧诱导因子-1α腺病毒载体的构建及鉴定
- 2007年
- 目的构建携EGFP的人低氧诱导因子(hypoxia-induciblefactor1alpha,HIF-1α)腺病毒表达载体,为研究人HIF-1α基因对冠心病的血管新生作用奠定基础。方法采用分子克隆技术,以KpnⅠ、ApaⅠ双酶切pcDNA3.1(+)-HIF-1α质粒获得HIF-1αcDNA,克隆到质粒pEGFP-C1,以NheⅠ、ApaⅠ双酶切得到EGFP-HIF-1αcDNA,重组到穿梭质粒pShuttle2,再以PI-SceⅠ和I-CeuⅠ双酶切重组穿梭质粒,获得含有EGFP-HIF-1αcDNA的表达盒,与线性化的腺病毒骨架质粒Adeno-XViralDNA连接,重组成pAdeno-EGFP-HIF-1α腺病毒质粒,脂质体法转染HEK293细胞,荧光显微镜下观察结果,在HEK293细胞中包装成为重组Adeno-EGFP-HIF-1α腺病毒,并进行PCR鉴定及滴度测定。结果经酶切鉴定及PCR证实重组腺病毒质粒构建成功,包装后冻融细胞的上清PCR检测重组腺病毒包装成功,病毒滴度为2×109nfu/ml。结论成功构建重组腺病毒Adeno-EGFP-HIF-1α,为冠心病的HIF-1α基因治疗研究奠定更直观的基础。
- 谢宜军王月刚郭寿贵童锴吴平生
- 关键词：低氧诱导因子-1Α绿色荧光蛋白基因治疗
