辽宁省科技厅自然科学基金(20072166)
- 作品数：4 被引量：10H指数：2
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- 相关机构：辽宁省医学细胞分子生物学重点实验室大连医科大学大连医科大学附属第一医院更多>>
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- 重组平滑肌肌球蛋白轻链激酶及ATP结合位点突变体的构建及表达
- 2009年
- 目的构建重组全长平滑肌肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)ATP结合位点突变体,以研究平滑肌MLCK的结构与功能。方法利用试剂盒对MLCKATP结合位点进行定点突变,构建全长平滑肌MLCKATP结合位点突变体重组表达载体pCold/BsMLCK/△ATP,在大肠杆菌中表达;利用SDS-PAGE鉴定表达的重组全长平滑肌MLCKATP结合位点突变体在细胞中的分布;运用亲和层析及凝胶过滤分离纯化重组全长MLCK并利用SDS-PAGE鉴定表达MLCK的纯度。结果重组全长MLCK/△ATP(突变型)在大肠杆菌中以可溶的形式大量表达;在样品的上清和沉淀中均有重组全长MLCK/△ATP表达;经CaM-Sepharose4B和Superose6HR纯化,SDS-PAGE鉴定得到单一的表达条带。结论重组全长MLCK/△ATP(突变型)可以在大肠杆菌中以可溶形式大量表达;SDS-PAGE结果显示重组全长MLCK/△ATP可以通过亲和层析和凝胶过滤纯化得到单一的条带。
- 崔颖谢策魏晓晴赵莹吕广艳王辉高颖
- 关键词：MLCK突变体
- ROCKⅠ/Ⅱ基因下调对血管平滑肌细胞迁移及增殖的影响被引量：5
- 2009年
- 目的:探讨ROCK亚型ROCKⅠ和ROCKⅡ对血管平滑肌细胞(A7r5)迁移及增殖的影响。方法:利用Western blot技术检测ROCKⅠ和ROCKⅡ蛋白在A7r5细胞中的表达水平;利用siRNA技术使ROCKⅠ和ROCKⅡ基因表达分别下调,并检测基因下调后蛋白表达水平;利用Boyden小室法,观察ROCKⅠ和ROCKⅡ基因下调后及ROCK特异抑制剂Y-27632对PDGF诱导的A7r5细胞迁移的影响;使用MTT法检测ROCKⅠ和ROCKⅡ基因下调后对A7r5细胞生长曲线的影响。结果:ROCKⅠ和ROCKⅡ在A7r5细胞中的蛋白表达水平不同,ROCKⅡ较ROCKⅠ的表达水平高4倍;通过对A7r5细胞进行ROCKⅠ和ROCKⅡsiRNA转染,使二者蛋白表达水平分别下调83.4%和94.7%;基因表达下调后,ROCKⅠ明显抑制了PDGF诱导的A7r5细胞的迁移,而ROCKⅡ无明显影响,Y-27632也抑制了A7r5细胞的迁移;ROCKⅠ和ROCKⅡ基因下调后对A7r5细胞生长曲线的影响无明显差别。结论:ROCKⅠ在血管平滑肌细胞迁移过程中起主导作用,ROCKⅠ和ROCKⅡ对血管平滑肌细胞的增殖作用无明显差异。
- 赵莹杨福春魏晓晴吕广艳崔颖高颖
- 关键词：ROCK血管平滑肌细胞细胞迁移增殖
- PDGF介导ROCK对血管平滑肌细胞基质金属蛋白酶-2的表达及活性的影响被引量：1
- 2009年
- 目的:研究PDGF介导ROCK亚型(ROCKⅠ和ROCKⅡ)对大鼠胸主动脉平滑肌细胞(A7r5)基质金属蛋白酶2(MMP-2)表达及活性的影响。方法:利用RNA干扰技术使ROCKⅠ,ROCKⅡ基因表达下调,并检测基因下调后蛋白表达水平;使用免疫印迹法(western blot)检测MMP-2蛋白的表达;使用明胶酶谱法检测MMP-2蛋白的活性。结果:通过对A7r5细胞进行ROCKⅠ和ROCKⅡsiRNA转染,二者蛋白表达水平分别下调79.8%和70.1%;ROCKⅠ,ROCKⅡ蛋白表达下调抑制了MMP2的表达和活性,但是ROCKⅡ作用更明显。结论:ROCKⅠ和ROCKⅡ均抑制MMP-2的表达和活性。
- 洪艳郭艳赵莹崔颖魏晓晴吕广艳陈海波高颖
- 关键词：血管平滑肌细胞细胞迁移基质金属蛋白酶
- PDGF诱导大鼠主动脉平滑肌细胞迁移模型的建立被引量：4
- 2009年
- [目的]建立PDGF诱导的大鼠主动脉平滑肌细胞(A7r5)迁移的模型。[方法]采用改良的Boyden小室法,以不同浓度(1、5、10、20、50和100 ng/mL)PDGF-BB为诱导剂,将不同浓度(1×105/mL、2×105/mL、4×105/mL)的A7r5细胞置入Boyden小室,分别培养5、7、9 h。迁移膜经Giemsa染色后,显微镜下观察迁移到下室的细胞,进行细胞计数。[结果]在无PDGF诱导时,迁移细胞数为每视野10个左右;而以10 ng/mL PDGF-BB诱导时,迁移细胞数每视野可达70个左右;当PDGF浓度达到100 ng/mL时,细胞迁移数降至每视野10个左右。随细胞浓度的增高,迁移细胞数目增加,细胞浓度为1×105/mL时,7 h迁移细胞数目为(48±8.944)个;2×105/mL细胞在5 h左右发生迁移的数目为(55±12.864)个,随时间延长而增多,在7 h前后增幅最明显,达(78±15.828)个(P<0.05);但细胞浓度为4×105/mL时,7 h迁移细胞数为(84±12.213)个(P>0.05)。[结论]以10 ng/mL PDGF-BB为诱导剂,以2×105/mL浓度接种,培养7 h建立的迁移模型为最佳。
- 崔颖白柳张金超杨福春李胜赵莹高颖
- 关键词：平滑肌细胞BOYDEN小室血小板源性生长因子
