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国家杰出青年科学基金(31125012)

作品数：15 被引量：22H指数：2
相关作者：杨洁高星杰苏超何津岩付雪更多>>
相关机构：天津医科大学江南大学教育部更多>>
发文基金：国家杰出青年科学基金国家自然科学基金天津市应用基础与前沿技术研究计划更多>>
相关领域：生物学医药卫生轻工技术与工程更多>>

文献类型

  • 15篇中文期刊文章

领域

  • 11篇生物学
  • 4篇医药卫生
  • 1篇轻工技术与工...

主题

  • 8篇细胞
  • 7篇蛋白
  • 7篇SN
  • 6篇质粒
  • 5篇应激
  • 5篇荧光
  • 4篇重组质粒
  • 4篇TUDOR
  • 3篇荧光标记
  • 3篇基因
  • 3篇D1蛋白
  • 2篇蛋白质
  • 2篇蛋白质类
  • 2篇融合蛋白
  • 2篇肿瘤
  • 2篇细胞应激
  • 2篇活细胞
  • 2篇基因表达
  • 2篇白质
  • 2篇UTR

机构

  • 14篇天津医科大学
  • 1篇江南大学
  • 1篇教育部

作者

  • 12篇杨洁
  • 11篇高星杰
  • 8篇苏超
  • 8篇付雪
  • 8篇何津岩
  • 6篇姚智
  • 6篇张毅
  • 5篇张春燕
  • 5篇任媛媛
  • 3篇尹洁
  • 3篇宋娟
  • 3篇史雪彬
  • 3篇葛林
  • 2篇张桂敏
  • 2篇张纬
  • 2篇王鑫廷
  • 2篇于林
  • 2篇辛灵彪
  • 2篇付晓
  • 2篇赵亚丽

传媒

  • 5篇山东医药
  • 2篇天津医药
  • 2篇中国生物化学...
  • 2篇天津医科大学...
  • 2篇中国细胞生物...
  • 1篇中国生物工程...
  • 1篇食品科学技术...

年份

  • 2篇2018
  • 2篇2017
  • 3篇2016
  • 1篇2015
  • 6篇2014
  • 1篇2013
共 15 条 记 录，以下是 1-10
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排序方式：
SND1蛋白与HuR蛋白相互结合作用
2014年
人源SND1（staphylococcal nuclease domain containing 1）蛋白由N端的SN（staphylococcal nucleases）结构域和C端的TSN（Tudor-SN5）结构域组成,其中SN结构域又包含SN1~SN4四个重复的功能片段.本课题组前期研究结果表明,SND1蛋白可以通过SN结构域与G3BP（Ras-GAP SH3 domain-binding protein）蛋白相互结合,共同参与细胞应激颗粒（stress granules,SGs）的形成.SGs是真核细胞在受到氧化应激、病毒感染等外界刺激时在胞浆内形成的与RNA代谢相关的颗粒状结构.对于SGs的成分鉴定及相互作用的分析一直是学者们研究的热点.本研究中,免疫共沉淀实验结果表明,以抗SND1抗体可以共沉淀出HeLa细胞内另一个重要的应激相关人类抗原R（human antigen R,HuR）蛋白.另外,利用脂质体转染法将pcDNA3-FLAG-HuR重组质粒瞬时转染入HeLa细胞,成功过表达外源性的FLAG-HuR融合蛋白,再以抗FLAG标签抗体又可以反向共沉淀出内源性SND1蛋白,证明SND1与HuR之间存在蛋白质间的相互结合作用.细胞免疫荧光实验结果表明,当给予HeLa细胞0.5 mmol/L亚砷酸钠氧化应激时,SND1与HuR蛋白共同定位于胞浆中的SGs结构中.GST-pulldown实验结果进一步表明截短的SN结构域可以结合HuR蛋白,其中以SN1功能片段的结合能力最强,表明SND1蛋白是通过SN结构域与HuR蛋白形成应激复合物,参与SGs的胞浆组装.并不定位于SGs的TSN结构域亦可结合HuR蛋白,提示SND1-HuR的蛋白相互作用可能并不局限于SGs,具有其它方面的功能意义.
高星杰张毅宋娟付雪苏超张桂敏张春燕于林姚智杨洁
关键词：免疫共沉淀结构域
针对人Tudor-SN蛋白T103位点的应激磷酸化抗体制备及分析被引量：1
2014年
目的:针对人Tudor-SN蛋白T103位点(103位苏氨酸,Thr103)制备兔源多克隆磷酸化抗体,并进行应激磷酸化的时相分析。方法:首先人工合成含磷酸化T103(pT103)位点的多肽,4次免疫新西兰大白兔后获取抗血清;然后以AKTA蛋白纯化系统进行纯化,并利用Western blotting和细胞免疫荧光实验对纯化后的抗pT103抗体进行鉴定;最后以In-cell Western法进行Tudor-SN蛋白的应激磷酸化/去磷酸化时相性分析。结果:(1)确定并合成磷酸化多肽"TIENKpTPQGRC",收集约75 ml兔源抗血清,纯化后获取2.08 mg/ml抗pT103抗体;(2)当HeLa细胞受到氧化应激时,以pT103抗体检测的磷酸化信号增强,可在胞浆中检测到颗粒状信号,与内源性Tudor-SN应激颗粒存在共定位关系;(3)在氧化应激及应激去除后恢复过程中,T103位点的磷酸化水平呈现一定的波动性时相。结论:成功制备针对Tudor-SN蛋白T103位点的兔源多克隆抗pT103抗体,有助于从磷酸化修饰角度进行Tudor-SN在细胞应激方面的机制探讨。
高星杰张毅苏超付雪史雪彬尹洁何津岩王鑫廷姚智杨洁
关键词：磷酸化抗体
稳定表达HMGA2的人乳腺癌细胞株MDA-MB-231构建被引量：2
2018年
目的构建人乳腺癌MDA-MB-231细胞人类高迁移率族蛋白A2(HMGA2)稳定表达株。方法取对数生长期MDA-MB-231细胞,提取细胞总RNA,逆转录含HMGA2基因的c DNA;以c DNA为模板,根据其CDS序列设计含有EcoR1、Bam H1限制性内切酶位点的引物序列,采用PCR法扩增出带有双酶切位点的HMGA2目的基因;采用双酶切法将目的片段连接到慢病毒表达质粒p LVX-IRES-Puro中,获得重组的p LVX-HMGA2表达载体。p LVX-HMGA2表达载体、包装质粒共转染人肾上皮细胞系293T,提取携带HMGA2的重组慢病毒。采用菌液PCR、重组质粒双酶切、质粒PCR验证及测序比对鉴定获得的重组质粒。取适量对数生长期MDA-MB-231细胞,分为两组,观察组、对照组分别感染重组慢病毒Plv-HMGA2、空载慢病毒Plv-Vector,感染48 h加入1μg/m L嘌呤霉素筛选。分别采用实时荧光定量PCR法、Western blotting法检测细胞HMGA2 mRNA、蛋白。结果观察组、对照组细胞HMGA2 mRNA相对表达量分别为10 273.93±4 290.77和1.18±0.81,二者比较,P<0.05。观察组、对照组细胞HMGA2蛋白相对表达量分别为1.570±0.080和0.110±0.002,二者比较,P<0.05。结论成功构建MDA-MB-231细胞HMGA2稳定表达株。
刘娇娇张慧变于林
关键词：乳腺肿瘤乳腺癌
hnRNP A1的增强型绿色荧光标记及细胞应激定位分析
2014年
目的构建包含有核不均一核糖核蛋白(hnRNP)A1蛋白编码区序列的真核表达质粒pEGFP-C1-hnRNP A1,并对增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记的hnRNP A1蛋白进行细胞应激共定位分析。方法提取HeLa细胞总RNA,以针对hnRNPA1-3′非翻译区的特异性片段为反转录引物,反转录出包含hnRNP A1编码区序列的cDNA,并以其为模板,降落PCR法扩增出带EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切位点的目的基因,利用双酶切法分别酶切目的基因片段和线性pEGFP-C1,在T4-DNA连接酶的催化下将两者连接构建成pEGFP-C1-hnRNP A1重组质粒,然后将重组质粒转染入HeLa细胞内,以激光共聚焦荧光显微镜观察EGFP-hnRNP A1的荧光表达情况,Western印迹法检测EGFP与hnRNP A1的融合表达情况,最后进行细胞原位杂交及细胞免疫荧光检测在氧化应激状态下EGFP-hnRNP A1蛋白与poly(A)+mRNA(应激颗粒的标记成分)及DPC1a(加工体的标记蛋白)的应激共定位。结果以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒无误,激光共聚焦荧光显微镜观察和Western印迹结果检测到绿色荧光融合蛋白的表达;EGFP-hnRNP A1蛋白与poly(A)+mRNA呈现共定位,但与DPC1a无共定位关系。结论重组pEGFP-C1-hnRNPA1质粒成功构建并表达,应激状态下EGFP标记的hnRNPA1参与应激颗粒的构成。
高星杰宋娟葛林付雪孙晓明张纬何津岩姚智杨洁
关键词：绿色荧光蛋白质类HNRNPPEGFP-C1
针对人SND1基因两个AUG的细胞应激分析
2014年
目的针对人SND1基因2个蛋白翻译起始密码子AUG构建真核表达质粒pCMV-N-Flag-SND1-No1/2,并分析2个AUG在SND1应激颗粒形成中的作用。方法以SND1全长转录本为模板,PCR法扩增含BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点的目的基因SND1-No1/2,双酶切法分别酶切目的基因片段和线性pCMV-N-Flag,以T4-DNA连接酶将两者连接成pCMV-N-Flag-SND1-No1/2重组质粒,然后将构建的重组质粒转染入HeLa细胞内,以Western印迹法检测Flag标签(DYKDDDDK)与SND1-No1/2的融合表达,最后以细胞免疫荧光实验检测在氧化应激状态下Flag-SND1-No1/2融合蛋白与内源性SND1应激颗粒的胞内共定位情况。结果以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒无误,Western印迹结果检测到融合蛋白Flag-SND1-No1/2的表达;细胞免疫荧光结果显示Flag-SND1-No1/2均可与内源性SND1应激颗粒共定位。结论重组pCMV-N-Flag-SND1-No1/2质粒构建成功,SND1基因第1个AUG的缺失并不影响SND1应激颗粒的形成。
高星杰何津岩葛林张毅付雪尹洁张纬史雪彬苏征姚智杨洁
关键词：重组融合蛋白质类应激质粒基因表达
活细胞内以光漂白荧光损失(FLIP)技术分析HuR蛋白的应激动力学行为
2014年
人类抗原R(human antigen R,HuR)是一种多功能RNA结合蛋白,参与细胞应激颗粒(stress granules,SGs)的构成。SGs是细胞在受到外界环境刺激时在胞浆中形成的颗粒状结构。该研究是利用光漂白荧光损失(fl uorescence loss in photobleaching,FLIP)技术对活细胞内的HuR蛋白颗粒进行应激动力学分析。首先,利用脂质体将RFP-HuR重组质粒瞬时转染入HeLa细胞,以Western blot和细胞免疫荧光实验确定是否实现对于HuR蛋白的红色荧光蛋白(red fl uorecent protein,RFP)标记;然后以405 nm激光束脉冲式重复光漂白HuR应激颗粒,分别监测同一漂白细胞内的其他HuR颗粒以及核内荧光信号,并以邻近的未漂白细胞作为对照组。实验结果表明,转染重组质粒后可有效表达RFP-HuR融合蛋白,且与SGs标记蛋白G3BP存在共定位关系。在第一个光漂白循环,漂白区荧光密度便从2 500 a.u.降低至0 a.u.;而经过约12个漂白循环(240 s)后,邻近HuR颗粒的荧光密度从漂白前的1 800 a.u.左右降低并维持在200 a.u.左右,表明活细胞内的HuR颗粒呈现高度的动态性;而胞核区荧光密度亦从4 400 a.u.降低至2 000 a.u.左右,表明HuR蛋白是一种核浆穿梭蛋白,在SGs、胞浆及胞核之间存在一定的动态平衡。利用FLIP技术可以分析并比较SGs不同成分的应激动力学属性,有助于进行SGs相关临床疾病的分子机制探讨。
高星杰张毅付雪苏超张春燕张桂敏尹洁王鑫廷姚智杨洁
关键词：活细胞荧光标记
利用CRISPR-Cas9基因编辑技术敲除H9c2细胞Tudor-SN基因对细胞周期的阻滞及增殖的抑制被引量：2
2018年
基因特异性敲除的细胞常用于生物学研究。近些年兴起的CRISPR-Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas9 nuclease)基因编辑技术越来越广泛地用于基因特异性敲除的实验中。本实验通过利用CRISPR-Cas9基因编辑技术,实现对大鼠心肌H9c2细胞Tudor-SN(tudor staphylococcal nuclease)基因的敲除,并观察其对H9c2细胞周期及增殖的影响。选择PX462质粒为载体,利用软件设计能特异性识别H9c2细胞Tudor-SN基因第2个外显子的上下游sgRNA(single-guided RNA),构建1对重组质粒。随后,将这对质粒共同转入H9c2细胞中,再挑选阳性单克隆细胞进行培养。Western印迹鉴定其敲除效果,并用敲除成功的细胞株通过流式细胞术及CCK-8(cell counting kit 8)实验进行细胞周期和增殖的检测。Western印迹结果显示,在阳性细胞中,Tudor-SN蛋白不表达,成功实现了对Tudor-SN基因的敲除。流式结果显示,Tudor-SN基因敲除(KO)细胞发生了G1期阻滞。G1期细胞占比由H9c2野生型(WT)细胞的54.28%±0.21%升高到KO细胞的61.96%±0.40%(*P<0.05)。CCK-8实验结果显示,KO细胞的增殖速率减慢。生长第6天的A值由WT细胞的2.82±0.03降低到KO细胞1.85±0.19(*P<0.05)。本实验成功构建了H9c2细胞Tudor-SN基因敲除细胞株,并检测到Tudor-SN基因敲除对细胞周期的阻滞及增殖的抑制,为研究Tudor-SN基因对心肌细胞功能的调控提供了便利的工具及研究的基础。
甘世虎崔晓腾马锦征房丽娇刘明霞任媛媛曹晓娜杨洁苏超
关键词：H9C2细胞
多功能G3BP应激蛋白的红色及蓝色荧光标记
2013年
目的:分别构建含有樱桃红荧光蛋白和蓝色荧光蛋白(BFP)标签的应激蛋白G3BP表达质粒,实现活细胞内G3BP蛋白的红/蓝色荧光标记。方法:以重组质粒pEGFP-C1-G3BP为模板,PCR法扩增出目的基因,分别利用EcoRI和BamHI双酶切法将目的片段连接到pmCheery-C1和pEBFP-N1载体上,再将构建成功的pmCheery-C1-G3BP和pEBFP-N1-G3BP重组质粒转染入HeLa细胞内,以激光共聚焦显微镜及Western印迹法检测红/蓝色荧光蛋白与目的蛋白G3BP的融合表达以及在活细胞内的共定位情况。结果:以单/双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒均无误,荧光显微镜及Western印迹结果均检测到红/蓝色融合蛋白的表达,共定位分析结果显示两者均可在HeLa细胞胞浆中形成应激颗粒。结论:pmCheery-C1-G3BP和pEBFP-N1-G3BP构建成功,对G3BP蛋白的红/蓝色荧光标记有助于进行其在细胞应激方面的机制研究。
高星杰葛林付雪张毅宋娟何津岩姚智杨洁
关键词：细胞应激重组质粒
活细胞内人AGTR1-3′UTR的荧光标记及应激定位分析
2014年
利用噬菌体衣壳蛋白MS2和带有序列特异性茎环结构(含有MS2蛋白结合位点)的RNA之间的高度亲和力,对外源性人血管紧张素1型受体(angiotensin II receptor type 1,AGTR1)mRNA 3′端非翻译区(3′untranslated region,3′UTR)片段进行红色荧光标记,进而在活细胞(HeLa)内研究该mRNA片段的应激生物学行为。通过在pSG5空载体质粒上先后插入两个双链DNA目的片段AGTR1-3′UTR和24×MS2,构建重组质粒pSG5/AGTR1-3′UTR/24×MS2,并将该质粒与重组质粒pERFP/MS2和pEGFP/C1-G3BP共转染入Hela细胞。荧光显微成像结果显示,AGTR1-3′UTR-24×MS2 mRNA片段能够携带具有入核信号的MS2-RFP融合蛋白离开胞核进入胞浆,而且在亚砷酸盐刺激下,红色荧光标记的AGTR1-3′UTR-24×MS2 mRNA片段可在胞浆中形成与应激蛋白G3BP-GFP共定位的颗粒。该结果表明,针对AGTR1-3′UTR片段的MS2-RFP荧光标记系统构建成功,该荧光标记系统能有效避免假阳性的荧光信号。在细胞受到氧化应激时,AGTR1-3′UTR会被招募至胞浆中的应激颗粒结构中,启示了AGTR1-3′UTR区域对于调控AGTR1 mRNA在细胞内的应激定位具有重要作用。
张毅高星杰付雪苏超史雪彬段中潮付晓何津岩杨洁
关键词：重组质粒荧光标记
pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒的构建及鉴定
2016年
目的构建并鉴定pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒,为深入研究Argonaute1蛋白在细胞应激及相关疾病的生物学作用奠定基础。方法提取He La细胞总RNA,反转录出含Argonaute1的c DNA;以Argonaute1 c DNA为模板,采用PCR法扩增出带有EcoRⅠ和Bam HⅠ双酶切的目的基因;采用双酶切法将目的片段连接到pmCherry-C1载体上;将构建成功的pmCherry-C1-Argonaute1重组质粒转染入He La细胞内,以Western blotting法检测Argonaute1与樱桃红(Cherry)蛋白的融合表达情况;以激光共聚焦显微镜观察细胞内Argonaute1蛋白与细胞应激颗粒的标记蛋白(G3BP)及加工体的标记蛋白(DCP1α)的应激共定位关系。结果以EcoRⅠ、Bam HⅠ单、双酶切及基因测序法鉴定构建的重组质粒无误;融合蛋白表达阳性;当细胞受到应激时,Argonaute1蛋白与G3BP、DCP1α蛋白共定位。结论本研究成功构建重组pmCherry-C1-Argonaute1质粒。该质粒可有效表达Cherry标记的Argonaute1融合蛋白,有助于深入研究Argonaute1蛋白在细胞应激及相关疾病领域的生物学作用。
崔晓腾高星杰张春燕付雪苏超任媛媛杨洁
关键词：重组质粒融合蛋白
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