国家高技术研究发展计划(2001AA215361)
- 作品数：6 被引量：22H指数：3
- 相关作者：刘玉峰王刚卢宁张海龙赵小东更多>>
- 相关机构：第四军医大学西京医院中国人民解放军海军总医院广州军区广州总医院更多>>
- 发文基金：国家高技术研究发展计划国家自然科学基金中国博士后科学基金更多>>
- 相关领域：医药卫生更多>>
- 大容量人源噬菌体抗体库的构建被引量：9
- 2006年
- 目的:构建大容量易于改造成Diabody的噬菌体单链抗体库,筛选人源性抗体。方法:从正常成人外周血和新生儿脐血中分离淋巴细胞提取RNA,经RT-PCR扩增轻重链可变区基因(VL和VH),通过重叠PCR(over-lapPCR)将VL和VH拼接成单链抗体(ScFv)基因(其中VH两侧是两个非同源的loxp基因),并克隆入噬菌体表达载体PDF,得到初级噬菌体抗体库。将初级抗体库以高MOI超感染Cre+菌株BS1365,通过loxp-cre定位重组系统,介导轻重链在菌内重组配对,然后低感染XL1-Blue菌,得到大容量的次级抗体库。以多种不同抗原对库进行筛选,得到多样性较好的特异性抗体。结果:经超感染重组,得到1·2×1010的大容量抗体库。经三种蛋白抗原筛选,均得到多株特异性较好的噬菌体抗体,并成功构建为活性较好的Diabody。结论:经Loxp-Cre定位重组系统在单细胞内重组,能够高效地构建大容量噬菌体单链抗体库。
- 陈宇萍张国民乔媛媛王刚刘玉峰化冰王琰
- 关键词：噬菌体展示抗体库单链抗体
- 对一株基因工程人抗角蛋白抗体的免疫学鉴定被引量：1
- 2005年
- 目的对1株基因工程人抗角蛋白抗体识别抗原的特性进行鉴定。方法利用从噬菌体抗体库中筛选到的特异表达抗角蛋白的Fab片段的质粒转化大肠杆菌,IPTG诱导表达出Fab片段,用ELISA鉴定抗原结合活性和特异性,用蛋白免疫印迹和竞争抑制性ELISA检测抗体所识别的角蛋白组分。结果该株基因工程人抗角蛋白抗体的结合活性和特异性良好,所识别的抗原为相对分子质量46000角蛋白,为特异性人抗角蛋白K17抗体。结论该抗体具有优良的免疫学特性,有必要对其生物学活性和临床应用前景做进一步探讨。
- 卢宁王刚刘玉峰李承新李巍张海龙赵小东
- 关键词：抗角蛋白抗体基因工程免疫学鉴定FAB片段蛋白免疫印迹识别抗原
- 人源性抗角蛋白单链抗体在巴氏毕赤酵母的分泌表达被引量：3
- 2005年
- 目的:用巴氏毕赤酵母表达人源性抗角蛋白单链抗体。方法:从已构建好的质粒p3MHScFv中亚克隆目的片段ScFv并插入酵母表达载体pPIC9K,构建成重组质粒pPIC9KScFv,并测序鉴定。通过电转将重组质粒pPIC9KScFv整合到巴氏毕赤酵母菌GS115的染色体上。经G418筛选得到高拷贝转化子及Mut表型鉴定后,用含0.5%甲醇的培养基诱导其分泌表达。结果:通过6天的诱导,该系统成功表达了抗角蛋白单链抗体,Westernblot实验证实表达产物具有特异性。结论:获得了真核表达的抗角蛋白单链抗体,为其应用研究打下了基础。
- 樊建勇王刚夏汝山陈宇萍高天文刘玉峰
- 关键词：单链抗体角蛋白毕赤酵母分泌表达
- 实验室条件下人角质形成细胞的培养技术(英文)被引量：5
- 2006年
- 背景:随着角质形成细胞体外培养技术的建立和发展,皮肤不再被认为是单纯的生理屏障,其在机体免疫和内分泌等方面尤为重要。目的:探讨实验室条件下人体角质形成细胞的培养技术,为角质形成细胞的多方面应用提供可靠的细胞来源。设计:开放性实验。单位:解放军第四军医大学西京医院临床免疫科和皮肤科。材料:实验于2003-03/2005-03在解放军第四军医大学西京医院临床免疫科实验室完成。选取同年4月西京医院泌尿外科门诊收治的1例6岁正常男性术后的包皮为角质形成细胞的来源。方法:①对表皮细胞分离过程采取两步消化法:首先运用离散酶对全层皮肤进行低温消化,将包皮皮片浸入质量浓度为2.5g/L的Dispase酶中,4℃过夜,次日分离表皮;第二步采用胰蛋白酶和乙二氨基四乙酸的混合液进行消化。②采用改良的无血清培养技术进行人体角质形成细胞的培养,培养基为人角质形成细胞无血清培养基+2.5mg/L牛垂体浸出液+5μg/L表皮生长因子+438mg/L谷氨酰胺,其中谷氨酰胺能促进角质形成细胞的生长。③将处于对数生长期的细胞进行人角质形成细胞的冻存和复苏,加入无血清培养基制成细胞悬液,调整细胞密度为5×105/mL接种入75cm培养瓶中传代培养。置于显微镜和透射电2镜下进行细胞形态观察。主要观察指标:①原代和传代细胞的生长情况。②不同代的角质形成细胞冻存和复苏情况。③角质形成细胞形态学观察结果。结果:①原代和传代细胞的生长情况:初期细胞悬于培养液中,逐渐细胞贴附于培养皿底部。一般在6～24h内开始贴壁,细胞以圆形为主,随着时间的延长伸展成椭圆型。3d左右可见数个角质形成细胞形成的小集落或小集簇,四周可见卫星样表皮细胞增殖,多数细胞为多角形,细胞的均质性和透明度加强。5d左右细胞融合范围可达70%,9d左右细胞融合达90%,11
- 卢宁朱平刘玉峰王刚张海龙赵小东
- 关键词：角质形成细胞细胞培养实验室
- 高亲和力抗角蛋白人抗体的基因工程制备被引量：3
- 2003年
- 目的 制备亲和力高、性能良好的人源性抗角蛋白抗体。方法 以人表皮角蛋白为抗原从噬菌体抗体库中克隆特异性抗角蛋白抗体,采用基因随机点突变和链替换(chain-shuffing)技术对所获抗体进行亲和力成熟,并对其生物学性能进行一系列鉴定。结果 经过筛选半合成抗体库和天然抗体库,成功获得了4株能与角蛋白特异性结合的人源性抗角蛋白IgG或IgM抗体;对抗体基因的随机突变未产生预期的性能改进,又选择其中活性最好的一株IgG抗体,通过轻链替换和重链替换使抗体亲和力得到了有效提高,达到8×1010/M的理想水平。结论 用基因工程的方法可以制备高质量的人源性抗角蛋白抗体。
- 王刚王琰刘玉峰
- 关键词：基因工程
- 基因工程人抗角蛋白抗体在角质形成细胞内的反应定位被引量：1
- 2005年
- 目的:探索一株基因工程人源性抗角蛋白Fab抗体在培养的角质形成细胞内的反应定位。方法:利用从噬菌体抗体库中筛选到的特异表达抗角蛋白Fab片段的质粒转化大肠杆菌,IPTG诱导表达出Fab抗体,纯化鉴定后将该抗体作用于培养的人角质形成细胞,在不同浓度和不同的作用时间应用免疫荧光细胞染色法及共聚焦显微镜观察该抗体在角质形成细胞内的反应定位,同时以基因工程抗HBsAg人Fab和1%BSA为对照。结果:基因工程人源性抗角蛋白Fab抗体作用于角质形成细胞的胞浆,呈明显的绿色荧光,着色均匀,细胞核未见着色,两种对照均未见着色。结论:基因工程人源性抗角蛋白Fab抗体,可与培养状态下的角质形成细胞胞浆中其特异性的抗原相结合,这为其临床应用奠定了基础。
- 卢宁王刚刘玉峰李承新李巍张海龙赵小东
- 关键词：基因工程细胞内抗角蛋白抗体FAB抗体抗HBSAG微镜观察
