上海市科学技术发展基金(024319115)
- 作品数：7 被引量：13H指数：2
- 相关作者：焦炳华王梁华孙铭娟罗以勤高云更多>>
- 相关机构：第二军医大学安徽医科大学附属省立医院更多>>
- 发文基金：上海市科学技术发展基金更多>>
- 相关领域：生物学文化科学医药卫生更多>>
- 人肿瘤抑素(Tumstatin)在E.coli中的克隆、表达及活性分析被引量：4
- 2005年
- 从人胚肾2 93细胞中扩增肿瘤抑素(tumstatin)基因,进行原核表达,纯化和生物活性检测.利用原核表达载体pMAL c2在大肠杆菌BL2 1中表达肿瘤抑素,经AmyloseResin亲和层析柱和QSepharoseFastFlow柱纯化,通过体外内皮细胞增殖、内皮细胞凋亡和鸡尿囊绒膜新生血管生成试验检测其抑制活性.MBP tumstatin在BL2 1中表达率约2 0 % ,肿瘤抑素纯度可达95 % .肿瘤抑素可明显抑制内皮细胞增殖(IC50 约为15 μg ml)、诱导内皮细胞凋亡和抑制鸡尿囊绒膜新生血管生成.研究结果表明,肿瘤抑素对内皮细胞具有明显的抑制作用,提示其在肿瘤治疗中有潜在的应用前景.
- 罗以勤王梁华球谊焦炳华
- 人血管生成素相关家族蛋白-1 angioarrestin基因真核表达载体的构建与鉴定
- 2007年
- 目的克隆人血管生成素相关家族蛋白-1angioarrestin基因,构建angioarrestin基因的真核表达载体。方法从人肝cDNA文库中经PCR扩增出angioarrestin基因及其C-端FDdomain,经纯化、回收目的片段,将其插入克隆载体pcDNA3.1/His-Myc(-)B,构建重组质粒pcDNA3.1-ARP和pcDNA3.1-FD,稳定转染大细胞肺癌NCI-H460细胞,RT-PCR和Western印迹法鉴定。结果从人肝cDNA文库中扩增出1473bp的angioarrestin目的片段及其C-端560bpFDdomain,构建的重组质粒pcDNA3.1-ARP和pcDNA3.1-FD经PCR及酶切鉴定与预期相符,经RT-PCR和Western印迹法确定稳定转染NCI-H460细胞成功。结论成功构建了angioarrestin和C-FD基因的真核表达重组质粒并转染NCI-H460细胞,为angioarrestin抗肿瘤血管形成作用机制的研究奠定了初步基础。
- 孙铭娟王梁华董晓毅宗英高云焦炳华
- 关键词：血管生成素1ANGIOARRESTIN转染
- 血管形成抑制因子tumstatin_(45-132)的基因克隆、表达和生物学活性被引量：3
- 2005年
- 目的: 克隆人tumstatin全长编码区基因及编码tum statin45-132的基因, 在大肠杆菌中表达。方法: 采用RT PCR从人胚肾细胞系 293细胞中克隆人的tumstatin全长编码基因, 继以PCR扩增tumstatin45-132 (45 -132位氨基酸 )编码基因, PCR产物克隆到pBV220载体中, 测序证实后, 转化E.coliBL21, 于 42℃进行热诱导表达。用SDS -PAGE分析表达产物, 对重组蛋白纯化后用内皮细胞增殖试验测定其生物学活性。结果: RT- PCR扩增出tumstatin全长编码基因, 以PCR扩增出tumstatin45-132的编码基因, 经序列分析证实与GenBank中的序列完全一致。以含有tumstatin45-132编码基因的表达载体转化E.coliBL21后, 可表达出相对分子质量(Mr)为 9 600的重组蛋白。表达产物的蛋白量占菌体蛋白量的 10%, 纯化后能抑制内皮细胞的增殖。结论: 成功克隆全长tumstatincDNA, 并在大肠杆菌中表达重组tumstatin45-132蛋白, 证实其具有抑制内皮细胞增殖的活性。
- 罗以勤王梁华球谊焦炳华
- 关键词：生物学活性
- 以MMP酶切位点为连接臂构建Vasostatin和TRAIL的融合蛋白及其生物学活性分析被引量：2
- 2008年
- 以基质金属蛋白酶(MMP)酶切位点(PLGLWA)为连接臂,采用重组PCR技术获得血管形成抑制素(vasostatin,V)和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL,T)的融合蛋白质编码序列,将该融合编码序列插入原核表达载体pMAL-c2中,重组质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导表达,分别得到MBP-VT和MBP-TV融合蛋白,Amylose Resin亲和层析柱纯化.初步纯化的融合蛋白MBP-VT在体外内皮细胞增殖抑制实验、肿瘤细胞凋亡诱导实验中显示了明显的活性,而MBP-TV的作用不明显;体外酶切实验和培养肿瘤细胞上清酶切融合蛋白的免疫印迹分析,证实融合蛋白MBP-VT皆能被正确酶切.上述结果表明成功表达了融合蛋白VT,该融合蛋白具有双重抗肿瘤活性,并可在肿瘤高表达的MMP作用下裂解为V和T.
- 郭爱云王梁华孙铭娟焦豫良任娜焦炳华
- 关键词：TRAIL
- Angioarrestin(hARP1)C端FD区的克隆、表达及其免疫活性鉴定被引量：1
- 2007年
- Angioarrestin是一种具有潜在应用价值的肿瘤血管形成抑制因子.利用DNA重组法构建了angioarrestinC端hFDcDNA和麦芽糖结合蛋白(MBP)重组原核表达质粒pMAL-C2-hFD.将重组质粒转入大肠杆菌E.coliBL21(DE3),经0.3mmol/LIPTG在37℃条件下诱导表达4h,SDS-PAGE检测,融合蛋白表达量约占细菌总蛋白的20%.Western印迹证实,目的蛋白N端带有MBP标签.取表达上清纯化、透析、浓缩并冻干,以此为抗原免疫Balb/c小鼠制备多克隆抗体.此多抗可以与pET-22b(+)表达系统获得的hFD重组蛋白发生良好的抗原抗体反应,ELISA检测多抗效价达1∶10240.实验证明:通过基因重组可获得angioarrestinC端hFD在大肠杆菌中的高效表达蛋白,且该蛋白具有较高的免疫活性.以此为抗原制备的抗angioarrestin多克隆抗体为深入研究angioarrestin提供了材料.
- 孙铭娟王梁华董晓毅宗英高云焦炳华
- 关键词：ANGIOARRESTINMBP大肠杆菌表达
- Tumstatin_(183-230)-TRAIL融合蛋白的克隆表达及其生物学双功能鉴定被引量：2
- 2008年
- 目的:克隆表达融合蛋白Tumstatin_(183-230)-TRAIL,并观察其生物学功能。方法:利用重组PCR技术扩增Tumsta- tin_(183-230)-TRAIL(Tu-T)的融合编码序列.构建pMAL—Tu—T融合蛋白表达载体,将其转化大肠杆菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达,得到MBP—Tu—T融合蛋白.用SDS-PAGE鉴定纯化的表达产物。通过体外内皮细胞增殖抑制实验、肿瘤细胞杀伤实验、体外管腔形成抑制试验及电镜检测细胞凋亡情况对其生物学双功能进行鉴定。结果:融合蛋白MBP—Tu—T在BL21中表达率约20%.可明显抑制内皮细胞增殖(IC_(50)12.5μg/ml),杀伤、诱导胰腺癌细胞凋亡并抑制体外管腔形成。结论:融合蛋白MBP-Tu-T具有双功能生物学活性,为进一步研究其靶向性杀伤肿瘤奠定了基础。
- 任娜王梁华高云孙铭娟焦豫良郭爱云焦炳华
- 关键词：融合蛋白生物学功能
- 细菌双杂交系统筛选与tumstatin45-132相互作用蛋白质被引量：2
- 2007年
- 目的 筛选与新生血管抑制剂肿瘤抑素功能性片段tumstafin45．132相互作用的蛋白质分子。方法 构建诱饵蛋白载体pBT-tumstatin45-132，通过细菌双杂交系统筛选人肝细胞eDNA文库；克隆表达MBP-tumstafin45-132及候选蛋白His-MMP-2，利用MBPpull-downassay和蛋白质印迹方法验证pBT-tumstafin45-132与候选蛋白MMP-2间的相互作用。结果 pBT-tumstafin45-132无自身转录激活活性，筛选人肝细胞eDNA文库，获得25个双阳性克隆，序列分析和同源检索表明所获其中之一候选蛋白为基质金属蛋白酶MMP-2；MBP pull-downassay和蛋白质印迹方法验证了pBT-tumstatin45．132与候选蛋白MMP-2间确实存在相互作用。结论 这些结果为进一步研究tumstatin 45-132新的功能和机制创造了条件。
- 罗以勤王梁华马筱玲孔建新焦炳华
- 关键词：肿瘤抑素相互作用蛋白基质金属蛋白酶-2
